不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白影响.doc

不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白影响【中图分类号】R684【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2011)08－0306－01 【摘要】目的：探讨不同条件对免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白时的影响。方法：分别应用磷酸盐缓冲液（PBS）和溶膜缓冲液（含去垢剂）作为反应系统，单克隆抗体PD4与胃癌细胞系MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀反应以获得PD4相关抗原，用Western blot检测膜蛋白的得量。结果：分离纯化PD4相关抗原时，用CNBr-Sepharose 4B-PD4进行免疫沉淀效果优于Protein A Sepharose 4B；溶膜缓冲液作为反应系统效果优于磷酸盐缓冲液。结论：免疫沉淀纯化膜蛋白时，应用抗体直接交联于Sepharose 4B和溶膜缓冲液作为反应系统效果更佳。 【关键词】免疫沉淀 去垢剂 蛋白质 Effect of different reactive condition on purification of membrane protein with immunoprecipitation 【Abstract】aim, To explore the effect of different condition on isolation and purification of membrane protein using immunoprecipitation. Method, monoclonal antibody PD4 immunoprecipitated PD4 associated antigen from detergent lysates of cell membrane of gastric cancer cell line MGC803 in phosphate buffered saline（PBS）or lysis buffer. Quantity of protein was measured with Western blot. Results, during isolation and purification of PD4 antigen, CNBr-Sepharose 4B-PD4 immunoprecipitated better than Protein A Sepharose 4B, lysis buffer was as reactive system better than phosphate buffered saline（PBS）. Conclution, it was better that antibody-conjugeted Sepharose 4B and lysis buffer were as reactive systerm using immunoprecipitation for isolation and purification of PD4 antigen. 单克隆抗体PD4是用胃癌细胞系MGC803免疫BALB/c小鼠，经筛选而得到的。前期工作表明，此抗体诱导MGC803细胞凋亡，明显抑制转化细胞Rat3-3在体外的增殖及在软琼脂中的集落形成能力，并能使该转化细胞在裸鼠中的致瘤能力丧失，其相关抗原在ras转化细胞表面呈高表达（1，2，3）。这些结果提示，单克隆抗体PD4相关抗原与肿瘤密切相关。因此，克隆单克隆抗体PD4相关抗原的基因，了解其结构及功能，将有助于我们认识肿瘤的发生、发展及转归规律。 抗体相关抗原的分子克隆，常用两种方法，一是用抗体直接筛选cDNA表达（或DNA）文库，以获得基因片段，二是纯化单克隆抗体相关抗原蛋白多肽，进行测序，根据氨基酸序列，合成兼并引物，通过PCR扩增获得基因片段，然后通过染色体步移或者RACE-PCR得到全长基因（4，5，6，7，8）。免疫学方法是分离纯化蛋白最常用，同时也是最为有效的方法。我们应用不同的反应体系，探讨用免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白的优化方案，为得到可测序的膜蛋白，进一步得到全长基因奠定基础。? 1 材料与方法? 一 细胞膜溶液的制备 收取2×108细胞，PBS洗3次，加入PMSF，使其终浓度为100μg/mL，液氮和37℃反复冻融4-5次以破碎细胞，4000rpm离心15分钟，收集上清，于100000g4℃离心1小时，去上清，向沉淀加1-2mL溶膜缓冲液（20mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl, 2mmol/L EDTA,1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠, pH7.5, 终浓度为100μg/mL的PMSF和2μg/mL的Aprotinin用时现加）悬浮细胞膜碎片, 4℃摇动30分钟，4℃10000g