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中药有效成分对α-葡萄糖苷酶活性影响探究[摘要]目的：研究中药有效成分2b对α-葡萄糖苷酶作用的影响，了解其对α-葡萄糖苷酶是否具有抑制作用以减少血糖中的葡萄糖来源，探索其降血糖作用机理，客观准确的评价其药效学作用。方法：以中药丹皮为原料，经过提取纯化得到降血糖有效部位PSM2b以及PSM2b的两个组分：PSM2b-1 ，PSM2b-2。建立一个体外的酶-抑制剂模型，测定其对酶作用的影响。结果：拜糖平的抑制率显著稳定，而中药2b及其两个分离峰抑制效果不显著。结论：PSM2b在体外对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。 [关键词]丹皮多糖（PSM2b ）；α-葡萄糖苷酶；酶-抑制剂模型 [中图分类号]R285 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）05（c）-093-02 中药丹皮是毛茛科芍药属牡丹的干燥根皮，主要成分为丹皮酚，丹皮皂苷及丹皮多糖等。丹皮酚已入药典，丹皮皂甙的研究已见报端。前期研究表明丹皮多糖的纯品PSM2b可降低葡萄糖和四氧嘧啶诱发的鼠高血糖，优于粗品和其他的纯品，并能升高糖尿病小鼠的SOD ApoA1 水平。降低GHb水平，改善小鼠口服葡萄糖耐量和胰岛素抵抗。其降糖机理可能与促进外周组织对葡萄糖的作用，提高机体对胰岛素的敏感性有关。 德国拜耳公司利用抑制小肠刷状缘上的α-葡萄糖苷酶催化水解α-1，4糖苷键，产生葡萄糖，研制出了降糖新药――拜糖平。其作用机制是竞争性的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。本课题组在前述工作的基础上，进一步探索丹皮多糖的降血糖作用，利用中药作用温和持久，并具有综合治疗作用、且作用的位点较多的优点，以期开发出一种新的中药降糖药物。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 丹皮：安徽铜陵凤凰山 α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）：Sigma公司，产品号：G3651 PNPG（4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷）：E.Merck公司 还原型谷胱苷肽：上海华美生物工程公司 丹皮多糖及其组分：研究小组提供 拜糖平：德国拜耳公司 其他试剂：国内试剂，分析纯 1.2 仪器 721分光光度计：上海第三分析仪器厂。 1.3 方法 1.3.1 α-葡萄糖苷酶活性的测定根据Tremblay等的方法测定α-葡萄糖苷酶的活性，即以PNPG为底物，0.5 mol/L Na2CO3溶液为终止液，1 mg/L的还原型谷胱苷肽为酶保护剂。在37℃，pH值6.8的条件下发应，400 nm波长处比色测定。其活力单位定义为：在37℃，pH值6.8的条件下，1 min内水解PNPG释放1 μmol PNP所需的酶量。根据Sigma公司提供的资料，我们得出酶活计算公式如下： 酶活=■ 说明：18.3――400 nm处的PNPG的消光系数。 V――反应的终体积 df――稀释因子 T――反应时间 1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂活性测定抑制剂活力单位定义：在37℃，pH值6.8的条件下，降低1个酶活力单位所需要的抑制剂量。 抑制百分比=■×100% 1.3.3 抑制剂浓度对抑制效果的影响在反应体系中抑制剂的终浓度分别是：0，10 ，50，100，200，800，400，1 600，4 000 μg/L。测定其抑制活力。 1.3.4 酶-抑制剂模型的建立因为酶反应体系受到包括：酶、底物、抑制剂、保护剂、温度、pH值及反应时间、终止方式等八个因素的影响，我们拟对其中两个主要因素：底物浓度和酶量进行研究，以便建立一个合适的酶-抑制剂模型。经过多次的实验，我们所建立的模型如下： 酶液：α-葡萄糖苷酶 底物：PNPG 抑制剂：拜糖平，PSM2b，PSM2b-1，PSM2b-2 保护剂：还原型谷胱苷肽 反映温度：37℃ pH值：6.8 （采用磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液） 1.3.5 反应体系中其他条件的确定①底物用缓冲液配成1 μmol/ml，加2 ml；还原型谷胱苷肽1 mg/ml，加100 μl；抑制剂根据终浓度确定用量。②根据文献以及Sigma公司提供的技术资料，反应时间定为20 min，终止液采用0.5 mol/L Na2CO3溶液。 1.3.6 底物量的选择反应生成的产物为PNP，我们经过多次实验后，选择PNP浓度在0.02-0.20 μmol/ml的一组数据利用回归分析法对其进行了分析。同时根据文献记载，光吸收值在0.2-0.7之间时，分光光度计的灵敏度较高。同时，我们综合酶动力学实验数据、Sigma公司的资料以及PNPG在37℃，pH值6.8的条件下，被α-葡萄糖苷酶催化生成1分子的PNP和1分子的葡萄糖。所以，我们最后