乌藤镇痛胶囊对类风湿关节炎家兔树突状细胞免疫活性影响.doc

乌藤镇痛胶囊对类风湿关节炎家兔树突状细胞免疫活性影响[摘要] 目的：研究乌藤镇痛胶囊对类风湿关节炎家兔树突状细胞(DC)的影响。方法：分离乌藤镇痛胶囊组（给药组）和非给药组（对照组）血液中单个核细胞(PBMC)，在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)的培养条件下制备DC，用流式细胞仪检测DC表面CD86的表达；混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对T淋巴细胞的刺激能力，酶联免疫吸附法(ELISA)测定MLR上清液中细胞因子水平。结果：两组比较，对照组DC表面CD86的表达明显增高，对T淋巴细胞的刺激能力增强， 致炎细胞因子 (IL-1β)分泌增多， 抑炎因子(IL-10)分泌减少。结论：乌藤镇痛胶囊可能是通过抑制树突状细胞激活T细胞的功能，而起到治疗类风湿关节炎的作用。 [关键词] 乌藤镇痛胶囊；大耳兔；类风湿关节炎；树突状细胞；细胞因子 [中图分类号]R593 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2007）02（b）-115-02 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的以关节组织慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病。病变关节主要表现为炎症细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成以及由此引发的软骨和骨质的损伤。抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）提呈自身抗原引起的T细胞异常活化是本病发病机制的中心环节。树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前所知体内功能最强的APC，成熟的DC可以刺激T细胞活化，从而使RA疾病发展，在RA的发病中有举足轻重的作用。乌藤镇痛胶囊由青风藤、制川乌、制草乌、独活、红花等中药组成，具有抗炎、镇痛、免疫抑制等药理作用，在治疗风湿、RA方面，该药已经在临床应用多年，具有较明显的疗效。通过以往的实验证明，本品可抑制体内IL-1β和TNF-α细胞因子的分泌，从而抑制免疫反应，减轻炎症损伤。本实验就乌藤镇痛胶囊对RA家兔体外培养的DC影响进行探讨。 1 材料与方法 1.1 动物 取大耳兔16只，兔龄10～12个月，♂性，体重3.5～4.0 kg。购自陕西省实验动物中心。 1.2 材料 RPMI 1640(L-glutamine)培养基、 胎牛血清(FCS)购自Gibco公司；淋巴细胞分离液购自天津TBD研究所；溴化-3（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑(MTT)、二甲亚砜(DMSO)购自广州威佳公司；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4 (rhIL-4)购自Peprotech公司； PE标记的鼠抗人CD86(B7-2)单抗购自Biolegend公司；白细胞介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)ELISA试剂盒购自美晶公司；流式细胞仪（德国PARTEC公司）。酶联免疫检测仪（华东电子集团医疗装备有限责任公司）。 1.3 方法 1.3.1 大耳兔类风湿关节炎模型的建立弗氏完全佐剂的制备：取无水羊毛脂4份，加热溶化后置于研钵中，稍冷却，边研边加入液体石蜡6份，高压灭菌。再按5 mg/ml加入灭活的卡介苗混合均匀，置于4℃冰箱保存备用。使用前将经硫酸钠3次重结晶的卵白蛋白充分乳化于弗氏完全佐剂中[1]，每周给两组大耳兔皮内1次注射1 ml，共4次。最后一次注射第9天，背部剪毛，第10天在背部皮内注射1％卵白蛋白，每个点注射量为0.2 ml，共注射10个点。在右足垫部注射乳化完全佐剂1 ml，诱导关节炎发生。 1.3.2 分组及给药方法将致炎后的大耳兔随机分成给药组和对照组，每组8只。对照组给生理盐水10 ml/kg，给药组给乌藤镇痛胶囊（本院中药制剂中心提供，批号：060918），按1.0 g/kg，用生理盐水调成混悬剂，灌胃给药，1次/d，连续给药15 d。 1.3.3 DC制备末次给药1.5 h后从兔心脏抽取血液20 ml，注入淋巴细胞分离液中离心(2 000 r/min，20 min)，收集单个核细胞(PBMC)，PBS冲洗2次，RPMI 1640冲洗1次，用完全RPMI 1640(含10%FCS)在6孔培养板中培养2 h(37℃，5% CO2)，去掉非贴壁细胞。贴壁细胞用完全RPMI 1640(含10%FCS、rhGM-CSF 100 ng/ml、rhIL-4 500 U/ml)培养液，置37℃、5%CO2温箱中培养7 d，隔天半量换液1次。收集培养第7天的悬浮细胞即DC进行实验。 1.3.4 DC形态于培养第1、3、5、7天在倒置显微镜下观察DC形态。 1.3.5 流式细胞学分析收集DC细胞，用PE标记的CD86(B7-2)单抗标记细胞，用流式细胞仪检测