酶活力的测定130304.ppt

第三章 蛋白酶活力的测定 一、概述 二、测定原理 三、试剂 四、操作 五、计算 六、注意事项 一、概述 1．酶的概念 2．影响酶催化反应的因素 3．酶的活力 4．测定方法 5．测定意义 1. 酶的概念 酶：一类由活性细胞产生的具有催化作用和高 度专一性的特殊蛋白质。简单说，酶是一 类由活性细胞产生的生物催化剂。 存在：动物内脏、植物茎叶、果实 微生物细胞 酶学发展史 公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。 1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。 1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。 1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。 1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。 酶的分类与命名 酶催化的化学反应性质：氧化还原酶、转移酶、水解酶等 酶在代谢调节中的作用：静态酶、调节酶、潜在酶 酶的来源和作用底物分：动物酶、植物酶、微生物酶 酶的最适作用pH与作用底物分类：酸性、碱性、中性 酶在细胞中合成后存在部分分：胞内酶、胞外酶 酶作用体系是否外加酶分：内源酶、外源酶 酶在基因工程中的应用分：连接酶、聚合酶、内切酶 2.影响酶催化反应的因素 底物浓度 pH值 温度 时间 酶浓度、激活剂、抑制剂 根据酶的最适pH分类 酸性蛋白酶 3350 pH最适= 2～4； 7401 pH最适= 3.0 中性蛋白酶 1398 pH最适= 7～7.5；166 pH最适= 7～8 碱性蛋白酶 2709 pH最适= 9 ～11； 209 pH最适= 9.5～11 （4）作用时间对酶反应的影响 Q（反应物的消耗量或生成物的生成量) t0（反应初速度时间） 酶催化反应 反应初速度时间内 最适温度 最适pH 饱合底物浓度 在最大活力处比较 3. 酶的活力 二、测定原理 酪蛋白 酪氨酸 显色剂 比色，OD 1．酶催化反应 条件： 底物浓度 温度 pH 时间 选择： C0 T最适 pH最适 t0 措施： C≥ C0 恒温水浴 缓冲溶液 t= t0 例子：537 酸性蛋白酶 0.5%酪蛋白 40℃ 3.0 10min 例子：1398 中性蛋白酶 0.5%酪蛋白 40℃ 7.5 10min 例子：2709 碱性蛋白酶 0.5%酪蛋白 40℃ 10 10min 2．显色 Na2WO4 Na2MoO4 H2O H3PO4 福林试剂→ 亮金黄色 HCL Li2SO4 Br2 显色反应 福林试剂 + 酪氨酸 OH- 蓝色物质 HO — —CH2—CH—COOH