丛枝菌根侵染率研究.docx

丛枝菌根研究方法检测孢子含量的方法A湿筛倾注法1. 称取一定重量的土壤样品（最好是取自15cm 表层植物根系附近的土壤），放在容器内用水浸泡20-30min，使土壤松散。如果土壤粘性很大，也可加入各种土壤分散剂。2. 选用一套洁净的具有孔径为0.5-0.034mm的土壤筛，依次重叠起来。最底层用一物体垫着（如培养皿、木块等物），使筛面稍微倾斜。3. 用玻璃棒搅动浸泡的水溶液，停置几秒钟后，使大的石砾和杂物沉淀下去，即将悬浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一层孔径最大的土壤筛上。倾倒时，最好集中倒在筛面的一个点上，不要使整个筛面都沾有土壤溶液。4. 用清水依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛出物，以免在上层粗筛面的剩留物中夹藏有VA菌根真菌孢子。5. 用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的培养皿里面，再将滤液通过细筛并用水冲洗。在冲下来的筛出物中，除有许多细的沙砾和杂质外，就含有VA菌根真菌的不同直径的孢子。6. 将含有筛出物的培养皿放在双目实体解剖显微镜下观察。B 蔗糖离心法1. 称取10 g菌剂，置入大烧杯中加500 ml水，搅拌，静置10 s。2. 先后过80目分样筛、400目分样筛，将400目筛子上的残余物用药匙转入50ml 离心管中，后用清水冲洗筛子，将残余物全部转入离心管中，配平，3000转/min 离心10 min。（注分样筛最好直径为12 cm左右，便于下面放置烧杯过筛）3. 去掉上清液，在离心管中加入预先配制好的质量分数为50%的蔗糖溶液，玻璃棒搅匀，配平，3000转/min 离心10 min（注意离心前离心管壁上不能有残余物）。4. 将400目筛子呈一斜面放置，离心后的蔗糖溶液过筛子的下侧，用水将筛子上的残留物轻轻洗入划线培养皿中。（注意水不能加太多以防影响检测，培养皿划线便于统计）。5. 解剖镜镜检统计培养皿中的孢子数目，计算出菌剂中的孢子含量。 注：溶于蔗糖溶液中的孢子仍可进行接种。A.Gerdemann J W, Nicolson T H,1963. Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, 46: 235-244B .刘润进，李晓林．2000．丛枝菌根及其应用．北京：科学出版社：190-194检测菌根侵染率的方法（曲利苯蓝染色改良法）Phillips J M，Hayman D S，1970. Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55: 158~161挑根—碱液软化—酸化—染色—脱色—制片、镜检1.将洗净的粗细合适的根系剪成 1 cm左右的根段至于三角瓶中。2.加入10% KOH在90℃的水浴锅中染色45~60 min(去除细胞质，便于染色。一般幼根需要时间较短约0.5 h，老根需要时间长约1 h，以根系相对透明为标准)。3.弃去碱液，用清水洗3~5次（晾至室温后再冲洗），加入2%盐酸室温下酸化5 min。4.加入0.05%曲利苯蓝于90℃水浴锅中染色30min。5.去除曲利苯蓝后，弃去溶液后用自来水冲洗，加入乳酸甘油溶液(1:1:1 )室温下脱色24h，（晾至室温后再冲洗，也可直接脱色）。6.用镊子夹取15条排列在载玻片上，每个样30条2个片，显微镜镜检（10×10）。说明：常规制片用水即可，或封固剂（聚乙烯醇1.66g，甘油1 ml，乳酸20ml ，蒸馏水10ml）制片片子可以保存较长时间，但容易产生气泡，经脱色后的植物根系可以在甘油中保存数月。三、统计方法Estimation of mycorrhizal colonization according to Trouvelot et al?丛枝菌根真菌侵染性的评估方法(Trourelot等，1986)Trouvelot A, Kough JL Gianinazzi-Pearson V (1986) Mesure du taux de mycorhization VA d’un système radiculaire. Recherche de méthodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In : Physi