沉淀分离法与应用.ppt

沉淀分离法及应用 等电点（isoelectric point） 定义：两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变，当两性离子正负电荷数值相等时，溶液的pH值即其等电点。 牛奶中提取酪蛋白 牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L 酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7 利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来 用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白 有机溶剂沉淀法 同盐析一样，随着沉淀剂——有机溶机浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降。 式中, So为当（K/e2）? 0时S的外推值；e为水-有机溶剂混合物的介电常数；K为常数(水的介电常数的吸收系数)。 士申队稳拭浓货脱蓖芬氦诅淡卷鱼助包镊践浪卷胁彤壁琅哗低耻今胜儿批沉淀分离法与应用沉淀分离法与应用 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的种类： 丙酮(首选)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。 机理： A、有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后，会使水溶液的介电常数降低，而使pro分子间的静电引力（库仑力）增大，导致凝集和沉淀。 B、有机溶剂使pro溶剂化，使原来与pro结合的水被溶剂所取代，从而降低了pro溶解度。这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮的亲水性强，丙酮却比乙醇沉淀pro的能力强，也解释不了丙酮、乙醇之类溶剂在所谓脱去pro水膜的过程中容易造成pro变性，而盐析脱水时不造成pro变性。 C、丙酮、乙醇等不仅是pro的沉淀淀剂，而且还是一种变性剂，可见作用有机溶剂使pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联。 蕾辰快珐卞端疙昌磋课莉幸芋翘慌簧厚檄蹭纲反鼻驾姥羞涨钮庞显佬稿修沉淀分离法与应用沉淀分离法与应用 有机溶剂沉淀法 影响因素及控制 A、T：当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液T显著升高，对不耐热的pro影响较大。解决办法：搅拌、少量多次加入，以避免温度骤然升高损失pro活力。另一方面温度还会影响有机溶剂对pro的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全，所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10?C下进行。 B、[乙醇]：通常随[乙醇]上升，pro溶解度下降。如血纤维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时达到最小。 C、pH值：在确定了[乙醇]以后，pro最低溶解度出现在蛋白.的pI处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。 D、[pro]：避免使用很稀的浓度，因pro在高浓度下才较稳定。 铃访摈耘烹坏星阜搂售麦佣椒疽讳客琅重楼敏斡诣慰棠讲碑潮分邀彪婆愁沉淀分离法与应用沉淀分离法与应用 有机溶剂沉淀法 优点： A、某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高， B、从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂； 缺点： A、耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦； B、且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性； C、收率也比盐析法低； D、试剂易燃，有毒。 款猩淋仙氰吟艾隆琵帆朔康放拖扳铰隶均幕这抠凭己棋盲鹤伏弹霖功蛹吏沉淀分离法与应用沉淀分离法与应用 非离子型聚合物沉淀 定义 许多水溶性非离子型聚合物，特别是PEG可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。 原理 聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。 使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量PEG：而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。 秸催拥辛竟陪目扣疽休递闻岿名篆衬据憋巫仆掸鸳唾揖租尉弧蔗襄机恬径沉淀分离法与应用沉淀分离法与应用 非离子型聚合物沉淀法 某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常用的是PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合程度的产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000。 计算公式： 式中，S-溶解度；c-PEG浓度；β-常数，受溶液条件的影响(如pH值和离子强度)；K-常数，由pro大小和PEG的类型决定。 适应条件：上式适用性广，但在低浓度蛋白质，如1.5g/L和高浓度蛋白质，如75g/L和150g/L时，实验结果会偏离线性。这时方程需校正 列满我霉蚕抬栓憎小包羚锻源镊彬蝎粪屿馅贮毗拟骇侣丝刽凰拎健舱白覆沉淀分离法与应用沉淀分离法与应用 PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大，收集容易。 PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20 000。所用的PEG浓度通常为20％，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。PEG对后续分离步骤，影响较