CRISR-Cas9技术.ppt

CRISPR/Cas9系统及其应用 1. CRISPR-Cas系统简介 1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史 1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。 2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定点插入。 1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 2、CRISPR-Cas系统的应用 2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术 基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因 基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点 2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术 CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 Mali 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白Cas9，在一段人为重组的sgRNA( small-guide RNA) 的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程RNA 进行DNA 改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。 例子：基因敲除的实验过程 2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活 在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ 结合的能力。这种失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为Dead Ｃas9。将ｄCas9与gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ 结合。如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始 2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活 CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ＤＮＡ配对 利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将ｄCas蛋白与具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的CRISPR－on系统。 真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子ＶＰ16结合获得。 3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景 3.1CRISPR-Cas9技术的优势 而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。 只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。 编码sgRNA的序列不超