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分子信标技术 分子信标简介 分子信标的结构 分子信标的工作原理 分子信标的应用 前景与展望 分子信标简介 Tyagi和Krammer于1996年首次建立，目的是在液相中定量测定靶标序列。 基于荧光共振能量转移（FRET）设计的一种新型荧光标记核酸探针 特殊的发夹结构使得其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强的特点 广泛应用于分子生物学和生物技术 分子信标的结构 经典分子信标结构包括： （1）环状区（长度15～30个碱基的序列，能与目标分子特异结合） （2）信标茎杆区（长度为5～8个碱基的互补序列，使得形成发夹结构） （3）5端的荧光基团（徳克萨斯红、荧光素等染料） （4）3端的猝灭基团（DABCYL ） 分子信标工作原理 影响分子信标的因素 荧光—猝灭基团间的距离的影响 环境pH值的影响 pH过高时，茎干区碱基对之间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光基团与猝灭基团分开产生荧光 波长转移分子信标 表面固定分子信标 量子点分子信标 双链DNA检测 前景与展望 近年来,分子信标技术得以飞速发展,已渗透到结 构和分子生物学、基因和生物技术等领域的各个方 面。毫无疑问的是分子信标技术有着广阔的应用空 间。 随着研究的深入,分子信标作为一种高特异性、 高敏感性的分子探针必将在基因结构、疾病诊断、 疾病机制、药物筛选等方面得到更广泛的应用。 * * 李舒艳 200425038 首例分子信标结构示意图 环状区 茎杆区 荧光基团 猝灭基团 无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生FRET，荧光猝灭，荧光背景极低。 加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRET的发生，荧光恢复。 E：FRET效率 R：荧光给体与受体之间的距离 温度对分子信标的影响 分子信标的应用 核酸的检测分析 实时定量PCR测定靶标浓度 活体内核酸的动态检测 同时检测多个靶核苷酸 检测双链DNA 研究DNA—蛋白质的相互作用 用于核酸酶的研究 用于研究DNA——蛋白质的相互作用 用作生物芯片和生物传感器 Demidov, V.V. (2001) PD-loop technology:PNA openers at work. Expert Rev. Mol. Diagn. 1, 343–351 PNA与双链DNA互补链结合时可以取代非互补链,使之解链以单链的形式存在,形成P-环结构。特定序列的DNA或PNA分子信标可以与双链DNA的变性部分结合,分别形成PD-或PP-环型化合物,分子信标结构被破坏,出现荧光响应。最近的实验结果表明,利用茎-环结构的DNA分子信标或无茎的PNA分子信标可以实时检测PNA与双链DNA的结合位点 Human osteosarcoma cell nucleus (U2OS cell line) vitally injected with a Cy3-labelled probe specific for chromosomal telomeric repeat sequenes. Note that some spots are relatively large suggesting association or clustering of multiple telomeres. Molenaar C et,el. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probes. EMBO J 2003,24:6631-6641. 　　　Whitcombe设计的一种将ＰＣＲ引物与分子信标相结合的蝎状引物荧光探针。在该探针中,ＰＣＲ引物与分子信标之间有一间隔臂,使ＰＣＲ反应不能往分子信标方向延伸。在ＰＣＲ过程中,非特异扩增产物不会产生荧光信号,而当特异性扩增产物生成时,分子信标将立即与其进行分子内杂交,同时发出荧光信号。 Working mechanism of the fluorophore–quencher-labeled MAB. The MAB exists at equilibrium between a nonstructured random coil and a compact intramolecular quadruplex. Addition of thrombin (gray ellipse) shifts the equilibriumin favor of the quadruplex structure, which