4基因克隆的载体系统.ppt

§4 基因克隆的载体系统 4.1 质粒（plasmid）载体 大肠杆菌主要的天然质粒类型： ① F 质粒：致育因子或性因子 ② R 质粒：抗药性因子 ③ Col 质粒：产生大肠杆菌素因子 基因工程中使用的质粒载体都是在天然质粒的基础上人工改造而成的。质粒载体是重组DNA研究中最常用的也是最重要的基因克隆载体。 4.1.1 质粒的生物学特性 4.1.1.1 质粒DNA及其构型 绝大多数质粒都是环状双链DNA分子 质粒DNA的构型： SC 构型：由cccDNA呈现超螺旋而形成； OC 构型：开环DNA（ocDNA）的构型； L 构型：双链断裂而形成的线性质粒 DNA分子。 （2）F质粒及起接合转移：详见遗传学相关内容 4.1.1.2 质粒DNA的转移 （1）质粒的类型 接合型质粒：能够自主转移的质粒。 非接合型质粒：不能自主转移的质粒。 4.1.1.3 质粒DNA的迁移作用 由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程 ColE1质粒的迁移： 2个相关基因： bom：ColE1 DNA 上的特异位点，是 Mob基因产物的作 用位点； mob：其产物是 ColE1 质粒特有 的弥散产物—核 酸酶，作用于 bom位点。 4.1.1.4 质粒DNA的复制类型 质粒拷贝数：（1）生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子的数目；（2）对应于每条细菌染色体平均具有的质粒DNA分子数目。 严禁型质粒和松弛型质粒 严禁型质粒：低拷贝数的质粒，每个寄主细胞仅含有 1~3拷贝； 松弛型质粒：高拷贝数的质粒：每个寄主细胞中可高 达10~60份 质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型之间有一定的相关性：接合型质粒由于具有较高的分子量，一般属于严禁型的；而非接合型质粒往往具有较小的分子量，一般属于松弛型质粒。 4.1.1.5 质粒的不亲和性（不相容性） 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个寄主细胞内稳定地共存的现象。 彼此间不亲和的质粒属于同一个不亲和群；而彼此间能够共存的质粒属于不同的不亲和群。 质粒不亲和现象的图解 4.1.2 质粒DNA的分离和纯化 为了在基因克隆中用作载体分子，要获得批量的纯化的质粒DNA分子。加入溶菌酶或SDS（十二烷基硫酸钠）来裂解大肠杆菌细胞，在从细菌细胞内分离得到质粒DNA，然后在进一步纯化质粒DNA，使其没有细菌染色体DNA片段、RNA、蛋白质等杂质的污染。 4.1.2.1 碱变性法 原理：在pH12.0~12.5范围内，线性DNA分子会被变性，成为线性单链分子；而质粒cccDNA的互补的两条链仍会紧密地结合在一起。在酸中和时，质粒DNA分子的两条链的复性迅速而准确，而随机断裂的线性DNA分子复性不会那么快速而准确，它们聚集成网状结构，在下一步的离心分离时与变性的蛋白质与RNA一道沉淀下来，滞留在上清液中的质粒cccDNA用酒精或异丙醇等试剂沉淀收集。 简要操作过程（投影） 4.1.2.2 微量碱变性法 如果质粒DNA需求量不多的情况下（或高拷贝质粒）可采用此种方法。此方法具有快速简便、经济实惠等优点，还可以同时抽提几种质粒DNA。方法同大量提取法相近。 4.1.2.3 氯化铯（CsCl）密度剃度离心法 如果实验需要高纯度、高质量的质粒DNA，可采用这种方法离心纯化质粒DNA 。由于在离心管中还要加入溴化乙锭溶液，所以也叫氯化铯-溴化乙锭密度剃度离心法。 在超速（或高速）离心状态下，氯化铯在离心管中形成密度剃度，而细菌裂解液或质粒溶液中的不同成分按其密度在氯化铯的不同密度层面分离存在，从而达到分离纯化的目的。 4.1.2.4 影响质粒DNA产量的因素 （1）寄主菌株的遗传背景 （2）质粒的拷贝数及分子大小 （3）实验操作误差 4.1.3 质粒载体的构建及类型 4.1.3.1 天然质粒的局限性 天然质粒在抗生素标记、限制性内切酶酶切位点、分