单向扩散试验平板法.ppt

第一节 沉淀反应原理及特点 沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。 沉淀反应分两个阶段 抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率 沉淀反应可分为三大类型 第二节　液体内沉淀试验 絮状沉淀试验 （flocculation） 絮状沉淀试验 表 最适比方阵测定法 免疫浊度测定（immunoturbidimetry） 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。 免疫浊度测定 1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力　　　　　　　强并使用R型抗体 3. 抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂 第三节　凝胶内沉淀试验 gel phase precipitation 原　　理 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。 单向扩散试验 （平板法） single diffusion test 单向扩散试验 （平板法） 单向扩散试验 （平板法） 影响因素： 抗体质量 标准曲线 ，质控血清 结果与真实含量不符 　单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高 双环现象 　不同扩散率抗原性相同的两个组分 双向扩散试验 （平板法） double diffusion test 双向扩散试验 （平板法） 双向扩散试验 （平板法） 双向扩散试验 （平板法） 第四节　免疫电泳技术immunoelectrophoresis technique 免疫电泳技术 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 　　3.增加了分辨率。 　　　 对流免疫电泳counter immunolectrophoresis,CIEP 对流免疫电泳 对流免疫电泳 结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。 沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。 火箭免疫电泳racket immunoelectrophoresis,RIE 火箭免疫电泳 火箭免疫电泳 1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。 2.电泳终点时间的确定。 3.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。 火箭免疫电泳示意图 免疫电泳immunoelectrophoresis　IEP 免疫电泳　 免疫电泳示意图　 免疫固定电泳immunofixationelectrophoresis,IFE 免疫固定电泳 免疫固定电泳示意图 免疫固定电泳 分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。 原理：区带电泳＋双向扩散 1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。 技术要点：制备琼脂板 打孔，加样于孔内，电泳2～3mA/cm ，0.5～1h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散 纯化抗原和抗体成分的分析及正常和 异常免疫球蛋白的识别与鉴定 影响因素 抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比 抗血清的的抗体谱 ，混合抗血清的使用 　　电泳条件直接影响分辨率 应　用 - + 免疫电泳原理，不同之 处是将抗血清直接加于电泳 后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物 ，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型 　 原理 区带电泳＋沉淀反应 先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带对照，作用一定时间后洗去游离蛋白质，染色后则可见被固定的相应M蛋白成分。 技术要点 　左图为IgG κ型, 中图为IgG λ型，右为正常 SP G A M κ λ SP G A M κ λ SP G A M κ λ 应用 最常用于M蛋白的鉴定与分型，也用于尿中本周氏蛋白质的检测与κ、 λ分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。 优点 *  第六章 沉淀反应 与经典的抗原抗体 反应相同 原理 特点 形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形