细胞培养全攻略1不要等一瓶细胞培养液完全用完才启用第二瓶.docVIP

细胞培养全攻略不要等一瓶细胞培养液完全用完，才启用第二瓶。最好第一瓶还剩一点时，就启用第二瓶，如果第二瓶培养液有问题（如被污染），不致于毁掉你所有的细胞。2、不要指望让自己的所有细胞“步调一致”，即在准备用来做实验的几瓶细胞较一致的同时，使另几瓶细胞量有多有少，以确保细胞不致于同时长过了死掉，或同时因瓶内细胞太少没长起来。3、有时候经验上的“多少瓶细胞长多满能接种多少块培养板”，比细胞计算板来得更可靠，毕竟用细胞计算板计算其实夹杂了太多主观因素。4、有时遇上长假，又不想把细胞都冻起来（毕竟重新复苏的细胞状态还是要差点），可以把吹打过细胞的吸管的头在新培养瓶的培养液中沾一下，继续培养，一般能保持一个星期以上没有问题。各人可以根据自己的细胞摸索一下。5、关于胰酶消化贴壁细胞，其活力主要在于浓度。所以我消化细胞时喜欢在倒掉旧培养液后将培养瓶立起来几十秒，吸去流下的培养液，吸极少量胰酶润一润，再吸走，再吸入一点点胰酶消化，轻轻摆动培养瓶，让胰酶浸润到所有的细胞。我试过多种细胞，一般这样消化个一两分钟，就可以吹打了。一般1ml胰酶能消化2～3瓶细胞没问题，而且效果强于倒掉旧培养液后直接滴入1ml胰酶消化10分钟（毕竟倒掉旧培养液后瓶内不止残留1ml旧培养液，再入1ml胰酶，其浓度只有原来的一半）。这是我看到别人的经验后试了下，改了下，不全是我自己的。1、细胞是有灵性的，养细胞的过程绝对是对耐心和爱心的锻炼。一种细胞养的时间长了，你会熟悉它的生长规律，比如按多少比例接种几天长至百分之多少，一瓶细胞长至多少时大概有多少个及某种细胞喜偏点儿酸还是偏点儿碱等等。而它会熟悉你的操作手法，比如消化后吹打的力度等等。总之，要想实验有好的结果，一定要人等细胞而不可细胞等人。状态再好的细胞，不经心的培养（长过没有及时传代或者消化不足吹打剧烈或消化过头等等）也得玩儿完；2、任何细胞在短期不用而需常规传代时，最好是两瓶步调不一致的细胞同时养着，以防污染或操作有误，又得重新复苏甚至绝种；3、如果一瓶细胞是由极少数细胞甚至单个细胞生长起来的，会形成一个或者几个细胞克隆，待克隆长至足够大时（这个因细胞而异）就应该消化下来重新接种，否则会因局部过密，细胞越长越小，状态也会不好；4、谈到细胞消化，我个人喜欢在显微镜下看着（多看几个视野），待细胞间隙即将打开，细胞有变圆趋势时就迅速拿进超净台，吸出胰酶，用培养基终止消化，消化适度是吸管一吹，细胞呈“流沙状”下来，而不是整片细胞全部脱落。当然，这个过程，这个“流沙状”还得根据不同细胞来摸索具体时间。而且这个时间也是不定的，与细胞代次（老化程度）、上次消化程度等都有关5、在均匀铺板方面，6孔板以上呈十字交叉型晃动（动作轻柔、力度一致）。24孔板先加入一定体积培养基，再将高浓度细胞悬液打入孔内，不要太慢。96孔板用排枪将细胞悬液贴壁轻轻慢慢打入就挺匀了。基础篇-无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽