截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选毕业论文.doc

截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选毕业论文 目录 要 I Abstract III 第1章 绪 论 1 1.1 工业微生物制药技术概述 1 1.1.1菌种的获得 1 1.1.2高产菌株的选育 2 1.1.3菌种保藏技术 2 1.1.4发酵工艺条件的确定 3 1.1.5发酵产物的分离提取 3 1.2 截短侧耳素国内外研究现状 4 1.2.1截短侧耳素简介 4 1.2.2截短侧耳素的结构与活性 4 1.2.3截短侧耳素产生菌及其选育 6 1.2.4截短侧耳素的发酵 7 1.2.5截短侧耳素的提取 8 1.3 重离子辐照微生物育种 9 1.3.1重离子加速器与重离子束概述 9 1.3.2重离子辐照在微生物育种中的应用 11 1.4 微生物发酵过程优化与响应面法实验设计 12 1.5 高通量技术与微生物筛选 14 1.5.1高通量技术概述 14 1.5.2高通量技术在微生物育种中的应用 15 1.6 本研究的主要内容与意义 17 第2章 重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌 18 2.1 材料与方法 18 2.1.1菌种 18 2.1.2仪器 18 2.1.3培养基与培养方法 18 2.1.3辐照样品的处理 19 2.1.4辐照方法及剂量的选择 19 2.1.5菌种的保藏 19 2.1.6辐照诱变后致死率和致死剂量的确定 19 2.1.7截短侧耳素含量测定方法 19 2.2 结果与分析 20 2.2.1贯穿辐照截短侧耳素产生菌的致死率 20 2.2.2注入辐照截短侧耳素产生菌的致死率与致死剂量 21 2.2.3注入辐照后存活菌株的正突变率 21 2.2.4注入辐照诱变高产菌株的筛选 22 2.3 讨论 23 第3章 截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化 24 3.1材料与方法 24 3.1.1菌种 24 3.1.2培养基配方 24 3.1.3仪器 24 3.1.4产量分析方法 24 3.2结果与分析 25 3.2.1主要影响因素的确定 25 3.2.2最佳发酵培养基的确定 27 3.2.3优化培养基的验证 29 3.3讨论 29 第4章 截短侧耳素高产菌高通量筛选方法的建立 30 4.1 材料与方法 30 4.1.1菌种与培养 30 4.1.2试剂与仪器 30 4.1.3高效液相色谱法测定发酵液中截短侧耳素的含量 31 4.1.4特征波长的确定 31 4.1.5高通量测定方法标准曲线的绘制 32 4.1.6常规发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定 32 4.1.7高通量固体发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定 32 4.1.8统计分析方法 32 4.2 结果与分析 32 4.2.1高效液相色谱法中截短侧耳素标准曲线的绘制结果 32 4.2.2Clitopilus passeckerianus高通量固体发酵与常规发酵的比较 33 4.2.3紫外检测方法特征波长 34 4.2.4高通量检测方法的标准曲线 35 4.2.5高通量检测方法的精密度 35 4.2.6高通量检测与常规检测的比较 36 4.2.7高通量筛选与常规筛选的比较 37 4.2.8高产菌株产量的稳定性 39 4.3讨论 39 结 论 与 展 望 41 参 考 文 献 43 致 谢 46 附录（硕士期间发表论文） 47  摘 要 截短侧耳素（pleuromutilin）是由高等真菌担子菌Clitopilus passeckerianus产生的一种二萜烯类抗生素，对青霉素-链霉素抗性葡萄球菌具有抑制作用。以截短侧耳素为起点人工合成的一系列截短侧耳素类抗生素具有优越的抗菌活性，人们认为它是对抗耐药菌的有力武器，极具研究价值，许多新型的截短侧耳素类抗生素正处在研发上市的各个阶段，因此截短侧耳素类抗生素的国内外需求量不断增大。原料药截短侧耳素的产量制约着截短侧耳素类抗生素发展，因此本研究对截短侧耳素产生菌进行了高产菌株的诱变选育。 选育高产菌株，必须考虑的因素有三个，诱变方法、发酵优化、筛选方法。前人使用了多种诱变方法选育截短侧耳素高产菌株，但Clitopilus passeckerianus为高等真菌，修复能力强，一般诱变剂不能对其达到良好的诱变作用。优化截短侧耳素发酵条件，前人多采用单因子试验或者正交试验，试验次数多，且无法找到最佳因素水平组合。截短侧耳素产生菌筛选耗时长，工作量大，是阻碍其应用发展的重要因素，急待建立快速筛选方法。基于以上原因，本研究的主要方法与结果如下： 重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌 兰州近代物理研究所重离子加速器产生的重离子束由于能量大，诱变作用强，突变不易修复的特点，越来越多的应用于微生物的诱变，并取得了良好的效果。本研究首次利用重离子辐照对截短侧耳素产生菌进行诱变，并筛选高产菌株。得到了碳离子诱变