人类DN、RNA提取、核酸内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳.ppt

琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支 持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核 酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度 有差异而分离，这种技术是基因操作中常用的一种 方法。 与其他支持物电泳最主要区别是：它兼 有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 （1）.适合分离大片段DNA。 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的 DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb（千碱基）,利用脉冲电泳，可分离高达 107 bp的DNA片段 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 （2）可提取大分子DNA 利用琼脂糖凝胶制成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段，可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求。 人类细胞质RNA提取 RT-PCR的原理、方法 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 人类细胞质RNA提取 真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、 tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%） 组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。 人类细胞质RNA提取 分离提纯RNA的目的 分析不同发育时期基因的表达状况 获得新基因 研究基因的拼接 分析相应的蛋白产物 人类细胞质RNA提取 分离高质量RNA RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值 RNA的不稳定性 由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA 易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活 性，不易失活。 所以需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性。 人类细胞质RNA提取 （1）常用的RNA酶抑制剂 焦碳酸二乙酯（DEPC）： 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 人类细胞质RNA提取 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 人类细胞质RNA提取 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 人类细胞质RNA提取 （2）RNA提取的一般步骤 RNA提取的一般步骤是： 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA 人类细胞质RNA提取 1.破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行 可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织 加入β-ME可以抑制RNA酶活性 2.分离RNA 一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。 人类细胞质RNA提取 3.沉淀RNA 一般用乙醇、3mol/L NaAc（pH-5.2）或异丙醇。 4.洗涤RNA 使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。 人类细胞质RNA提取 5.融解RNA 一般使用TE。 6.保存RNA 应该尽量低温。为了防止RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存也应该如此。 人类细胞质RNA提取 所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源ＲＮＡ酶的有效抑制； 有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 RT-PCR RT-PCR：逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 RT-PCR PCR基本步骤： A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一