小鼠脑组织病理总结.ppt

小鼠脑组织病理实验总结 内容 石蜡切片的制作 冰冻切片的制作 免疫组化 免疫荧光 HE 病理相关试剂配制 注意事项 石蜡切片的制作 取材和固定： 处死动物后或者灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中。 脱水和透明：梯度酒精和二甲苯 浸蜡和包埋：石蜡 切片制作：切片 贴片：捞片，展片 保存：烤片 冰冻切片的制作 取材和固定： 灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻。 脱水和透明：梯度蔗糖 包埋：OCT，3%聚乙烯醇。 切片制作：切片 贴片：直接贴 固定：冰冻丙酮3-5分 保存：-20°C 灌注 0.5%戊巴比妥钠100mg/Kg麻醉小鼠，5分钟左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用酒精棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部肌肉层，剑突上成V型剪开胸廓，暴露心脏，剪掉右心耳（即视野下心脏上色暗红组织），与心尖处30°角刺入左心室，37°左右生理盐水约10ml缓慢注入，冲净血液止，换4%多聚甲醛溶液（4°预冷），10-20分钟，鼠僵硬为好。 固定 4%多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切片的固定时间不同，几小时到一周。 我曾用过2天，可以。 冲水，固定的时间越长冲水时间越长，预防甲醛沉积。 取脑 断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从枕骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰开露骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织勾出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑区组织，厚3mm左右。 脱水和透明，浸蜡 石蜡切片：75%，80%，85%，90%，95%（2个），无水乙醇（2）中每个4小时-过夜，正丁醇1-2天。二甲苯（2个）20-30分钟。三个蜡，每个大于2小时。 冰冻切片：固定后脱水用10%20%30%蔗糖（0.1MPBS溶）每个室温下4小时——过夜，OCT包埋，先在锡纸盒冻一层，在中间放组织，切面朝下，再用OCT将组织没过，尽量减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平，待中心尚透明时取出，放于-80°C保存。 切片 石蜡：冷水——温水（54°-56°）—— 烤片（80°） 切好烤片后可以室温保存。 冰冻：切片温度-18°—-20° 直接贴 切好于冰冻丙酮中固定5分后-20° 保存。 固定方法注意事项 1.组织块大小2cmx2cmx0.5cm 2.组织标本应及时放入固定液中,切忌干涸 3.组织固定后必须冲洗,除去多余的固定液 4.一般固定剂温度以室温,某些病毒则须低温 下处理,用丙酮-20度至-40度固定30分钟 5.浓度采用10%中性甲醛或4%多聚甲醛 6. 固定液量是标本体积20倍 7.固定时间不超过24小时 组化实验设计 1.对常规组织切片进行仔细观察,根据可提供形态学特点,选择最佳并能反映病变的组织标本 2.列出免疫组化的指标 3.进行预实验(设立阳性、阴性对照) 4.找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育温度及孵育时间 5.每张切片应表明抗体名称,防止相互混淆 实验过程 —70°考片一夜 —二甲苯3个每个10分钟无水乙醇，95%，90%，85%，80%每个10分钟 —3%双氧水阻断室温10分钟（现配现用） —抗体修复液（现配，400ml一次一个抗体盒） 微波炉高火6-7分 —冷却至室温 —再修复一次冷却 —PBS5分×3 —擦片加一抗，4°过夜 —第二日PBS5分×3 —加二抗 室温20分 —PBS5分×3 —DAB显色 —水冲5-10分 —苏木素1-3分 —水冲10-15分 —80%85%90%每个3分 —95%（2个）无水乙醇（2个）二甲苯（2个）每个5分 —中性树胶封片。 免疫荧光 —PBS5分×3 —5%BSA室温封闭1小时 —加一抗，4°过夜或根据说明书时间 —第二日PBS5分×3 —加二抗37°孵育1小时 —PBS5分×3 —DAPI染色 —PBS2分 —丙三醇封片荧光显微镜下观察照相。 HE —70°烤片一夜 —二甲苯3个每个10分钟无水乙醇，95%，90%，85%，80%每个5分钟 —苏木素1-5分 —水 —盐酸酒精 —水 —0.5%氨水 —水 —95%酒精2分 —0.5%醇溶伊红1秒 —95%酒精30秒 —95%酒精，无水乙醇（3个）每个2分 —二甲苯（2个）每个2分钟 —中性树胶封片，吹干 病理相关试剂配制 4%多聚甲醛：40g多聚甲醛粉末溶于500ml水（50°左右）黄枪头加一滴1M氢氧化钠至澄清，冷却至室温，与500ml0.2MPBS混合，滤纸过滤。 0.2MPB:1000ml 0.2M磷酸氢二钠810ml称57.996g 0.2M磷酸二氢钠190ml称5.9