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骨骼肌TEF1转录因子下游靶基因Nudt6和Tcta的克隆、测序、SNP检测及关联分 1 前言 1.1 研究背景 骨骼肌的生长速度是猪的生产性能的主要决定因素之一，动物的产肉力与肌纤维细胞的数量、长短、横截面积和生长密切相关（Oksbjerg et al.，2004）。因此加快肌肉的生长速度和提高瘦肉率一直都是猪遗传改良研究的重点。但由于猪的产肉性状大多是由多基因控制的数量性状，通过常规选育难以进一步提高。因此结合分子标记辅助选择进行猪育种改良，可以为猪肌肉经济性状的遗传改良研究注入强大的新动力，已成为一种趋势。近年来，猪的分子遗传育种取得了很大的进展，许多新基因被分离克隆，并与猪肉质性状、胴体性状和生长性状进行了关联分析，从而为现代分子遗传标记应用于猪遗传育种提供了分子遗传基础，并推动了猪育种的发展。因此对重要经济性状候选基因的分离克隆和研究，为加快我国养猪业的发展、加速猪新品种的培育具有非常重要的意义。猪的生长性状是提高养猪生产效率的重要基础，是当前养猪业中的一个重点。而猪的生长性状关键在于肌肉的生长，因此对肌肉生长相关的候选基因的研究成为必要。 1.2 TEF1在肌肉生长发育中的作用 myoblast）分化决定阶段、成肌细胞的形成与分化阶段和肌管（myotube）形成阶段（Scott, 2003）。 骨骼肌不同阶段的演化涉及到许多细胞因子（如调节因子，成肌决定因子，细胞周期作用因子和增强因子等），还包括细胞凋亡过程。目前已经鉴定的调节因子包括转录因子、信号分子及生长因子。 TEF1是一个重要的转录因子，在肌肉特异基因的表达中起着比较重要的作用，TEF1的TEA结构域不但能与肌肉特异基因的M-CAT元件作用，还能与其他因子的MADS结构域作用调节其它的肌肉基因的表达。（邱海芳，2009） 1.3 两个拟分离基因的研究进展 本实验室的邱海芳博士（2009）已经运用ChIP-on-chip（染色质免疫沉淀技术chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）TEF1转录因子在肌肉组织中的下游靶基因，并进行了GO分析和调控通路分析。筛选了745个靶基因。其中大部分基因参与了转录调控相关的细胞过程，在肌肉生长发育过程中发挥了重要作用。本实验选取邱海芳博士ChIP芯片中Nudt6和Tcta基因进行研究，。 1.3.1 Nudt6的研究进展 核苷二磷酸连接X型基元6基因（nudixtypemotif6，Nudt6），又叫GFG基因；属于Nudix(nucleosidediphosphatelinkedmoietyX)水解酶超家族。这些水解酶的主要底物是连接了X成分的核苷二磷酸（nucleosidediphosphates）（X代表任意氨基酸）。Nudt6基因人定位于4q28.1，有两个转录本，长约1kbp。在小鼠中，Nudt6定位于3号染色体，长约1.1kbp。在结构上，Nudt6基因与bFGF在3′端有460个左右核苷酸有互补性。它编码一个35kDa的GFG蛋白。GFG蛋白在多种组织表达，但是目前关于其具体作用还知之甚少。 Nudt6基因的mRNA是FGF2反义链转录而来，所以又叫反义FGF。FGF的反义转录本1989年首次在非洲蟾蜍中鉴定。 Nudt6基因在转录后水平调控FGF2基因的表达。在细胞内，FGF2基因的正义链mRNA和反义链mRNA以稳定的双链结构存在。Nudt6基因在转录后直接结合到FGF mRNA的3非翻译区端，形成双链结构。而3’端非翻译区在决定bFGF的mRNA稳定和翻译起始有重要作用。所以，反义链mRNA可以稳定FGF2基因的mRNA，调控FGF2的翻译。在mRNA转录水平，Nudt6基因不影响FGF2基因，但是可以抑制细胞内的FGF2蛋白，而且这种转录后的调控作用直接和Nudt6的mRNA表达量正相关。过表达其RNA可以抑制细胞内总FGF2，核内聚集FGF2减少。细胞周期停留在G期，延迟进入S期，达到调控细胞周期，控制发育的作用。在某些肿瘤病人，Nudt6的表达水平与提高生存率，降低复发率有重要联系，特别是bFGF表达异常的病人。 朱纲华等（2007）研究了Nudt6在小鼠内耳的表达，发现Nudt6和FGF2在耳蜗损伤后修复过程中起着重要作用。Shuo Cheng Zhang等（2007）研究了Nudt6在人的多种组织以及食管癌中的表达，发现Nudt6和FGF2的过表达可以减少食管癌的复发率。而在猪上面还没有关于该基因的报道。 1.3.2 Tcta的研究进展 1995年Aplan等在T细胞白血病易位断点t（1；3）（p34；p21）克隆并鉴定了一个新的基因，并命名为Tcta（T细胞白血病易位相关基因），定位到3p21。Tcta的mRNA在各种组织中都有表达，尤其在肾脏中表达