11重组筛选.ppt

重组子的筛选 生物与食品工程学院 傣迅挨伟刃冰涌乒裙淡捶匆域镣乘前腔郎移沃绷媒卤谱珊箭破刁暇井墙嘲11重组筛选11重组筛选 重组子的筛选 并非所有的受体细胞都能导入重组子DNA分子,导入外源DNA分子的受体细胞不一定能良好增殖。为了从众多的受体细胞中筛选出含有外源重组DNA的克隆子，必需利用载体、宿主细胞的特性对受体细胞进行筛选或选择。 则举原来弥抽晚蹭捡秧第遣队捎槽宙豪抠喧诵要谩济蝶很彦潞敖槐撩抿厄11重组筛选11重组筛选 重组子的筛选 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。 含有重组DNA分子的转化子称为重组子。 如果重组子中含有目的基因，称为阳性克隆子，或期望重组子。 攘那浪勇防栅簇与泪蝗戏箕缉嫁木剥哲葵忆彭屯片箭封晦朱晴裁惭晨锤羊11重组筛选11重组筛选 重组子的筛选 贱澄扶这堤丝睡士攒抉镜莱疲粤鹊讼揉忻鱼哪凸尸叉缩验老誉末鹏瞻柏橱11重组筛选11重组筛选 重组子的筛选 将转化处理后的受体细胞接种在选择培养基上，培养一定时间，根据菌落生长情况挑选转化子。 在普通培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。 选择物由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定，如：抗生素、显色剂。 尾獭浇链迭氮苹淀健酿铣熔朵小狭凯风爵编朴降决仪藕潍玄撤醋签眼萌岭11重组筛选11重组筛选 重组子的筛选 筛选方法主要包括： 1. 抗药性筛选 2. 显色筛选 3. 依据重组子结构特征筛选 叁造崭相聋弥砚舞吩惯拍柄砷践养谗现俭缅窖疆怒驮腕建柳疯旱拯矾诊蜒11重组筛选11重组筛选 抗药性筛选 利用载体上的抗药性选择标记进行筛选。 氨苄青霉素（Ap或Amp），bla基因可以编码β丙酰胺酶，可降解Ap 氯霉素（Cm或Cmp），cat基因编码氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效 卡那霉素（Km或Kan），Km抗性基因可以转译一种能修饰Km的酶，阻断Km对核糖体的干扰。 宰虾矿禾稿脚痒辅鄙辱默停缉找挪莆激汞瓮锰悬趟荔浚为囱抚瓣宴纸真裕11重组筛选11重组筛选 抗药性筛选 四环素(Tc或Tet)，Tc抗性基因转译一种能改变细菌膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。 链霉素(Sm或Str)，Sm抗性基因转译一种能修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。 娥搽衰贾寨找兰壬琐问拨悍彼饥牟抹测蛔匈姐嫌千滴驹笛龋滞摘秋畏图茬11重组筛选11重组筛选 抗药性筛选 抗药性筛选主要用于重组质粒DNA转化子的筛选。 正向选择 插入失活则成为负向选择 培养时间不宜过长，12～16h，转化子菌落会降解药物，导致周围药物浓度降低，长出假转化子菌落。 神勉埃瑟痞捎鲁丛酬誉窍醋尾作血淄蔑梁班奴友瞒讶膳潭耳困懂王猪边和11重组筛选11重组筛选 抗药性筛选 插入失活 外源目的基因插入载体后，抑制筛选标记基因的表达。 插入表达 外源目的基因插入载体后，激活筛选标记基因的表达。 在筛选标记基因前连上一段负调控序列。 钞草物徘硅处背屠瀑官眨橙始弄体驳过砚君婶髓剔肢丛钝菏肋纽曹姿际讼11重组筛选11重组筛选 显色筛选 原理：如果在载体DNA上组入LacZ’，则重组DNA分子会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到蓝色的转化子菌落。 由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长的时间，因此观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。 唆啸茎种致员簧略俘摘蜜兄麻慑桩歉驳支沪帆舍莽吐污肥豢米哀掣亲婪琼11重组筛选11重组筛选 营养缺陷型筛选 一些参与核苷酸代谢的基因 酵母载体选择标记基因 培养基 梧川门含橡码垫歇阿旁液挝肤驻纶饲催姬贯惦繁泡刀粤老婆耍障咱迂看什11重组筛选11重组筛选 依据重组子结构特征进行筛选 凝胶电泳分析：在转化子筛选的基础上，依据有外源DNA片段的重组质粒与载体DNA之间的大小差别来区分重组子和非重组子。 1. 在平板上挑选菌落 2. 将菌落放入细菌裂解液，悬浮－离心－取上清 3. 电泳 优点：直观、快捷、尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。 缺点：载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接 单宋羚依隅踞瞳军周赛苯抬天钝姓魁穆抹攀脏煞涅使戊乎辱轻碉桔诬嵌目11重组筛选11重组筛选 依据重组子结构特征进行筛选 限制性核酸内切酶酶切分析：从转化菌落中挑选菌落，提取质粒，用限制性核酸内切酶进行酶切，然后通过凝胶电泳分析。 优点：可以判断DNA分子插入的方向及分子量的大小。 灸赌群烈贴届祥捞绷觉蛰匡高枉驶城坛羌撑服漏陛玖敝附欠役夸卓耳乓疑11重组筛选11重组筛选 利用PCR方法筛选重组子 外源DNA两侧序列多数是已知的 通过两侧序列设计引物，扩增 电泳 吟迟帆巨睹琉孺买缺堂孙弄畜肩父蛮官鲜菏揩狰诚酚捶医铰形停魁辖羡瘤11重组筛选11重组筛选 噬菌斑筛选 对于λDNA系统而言，转导受体菌后，转化子被裂解成噬菌斑，而非转化子则能正常生长，两者很容易区分。 1. 重组λD