ITRAQ技术简介.doc

iTRAQ技术简述 1. 研究背景 1994年，Marc Wilkins在Siena双向凝胶电泳（two-dimensional electropho- resis，2-DE）会议上最早提出了蛋白质组（proteome）概念，并于1995年7月的Electrophoresis杂志上发表。随着高通量、高灵敏度、高分辨率生物质谱技术的出现，蛋白质组学技术取得飞速发展，人们不再满足于对一个细胞或组织的蛋白质进行定性研究，而是着眼于蛋白质量的研究，于是蛋白质组学概念就被提出，并得到了广泛的应用。 ?蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质（protein）与 基因组学（genomics）两个词的组合体，表示“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学研究，就是要把一个基因组表达的绝大多数蛋白质或一个复杂的混合体系中绝大多数蛋白质进行精确的定量和鉴定。 蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学是一门以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学。目前必威体育精装版的iTRAQ蛋白定量分析技术在此基础上被提出，并被得到广泛应用。 仅仅知道蛋白质的身份并不足以对蛋白质给出最终定论，因为蛋白质的浓度对于实现其在细胞中的功能来说极其重要，一种特殊蛋白质在浓度上的变化，就能预示细胞的突变过程。因此，科学家能够对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量，是很重要的事情。过去，科学家通常先进行二维(2D)凝较电泳，切断条带，再用质谱方法测量条带中的蛋白质。可是，这种方法不是很理想：既不是非常敏感，也不是非常精确。 新泽西医学及牙科大学的蛋白组学研究中心主任Hong Li说：“当我们开始蛋白组学研究时，就采用2D凝胶技术，但得出的信息量却让大伙很失望，因为许多蛋白质已经改变了自身的代谢过程，如热休克蛋白或者是管家蛋白。” 蛋白组学中的方法一直在不断提高。基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。定量蛋白组学是蛋白质组学的一个重要组成部分，即对一对基因组表达的全体蛋白或一复杂的混合物体系中所有蛋白质进行定量和鉴定。常用的定量蛋白质组学的研究方法包括DIGE（difference gel electrophoresis）、iCAT（Isotope-coded affinity tag）和SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures)。 iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）是美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年新开发的一项蛋白定量技术。iTRAQ和iCAT是这些新进展中的两大主力，但是，新技术也有不尽如人意的地方，需要不断改进。 2. iTRAQ技术介绍 2.1技术简介 iTRAQ技术是一种新的、功能强大的可同时对四种样品进行绝对和相对定量研究的方法，这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。 iTRAQ实际上是一种同位素标记试剂，包括一个带电荷的报告基团，报告基团有4种相对分子质量分别为114、115、116和117，另外还有一个肽段反应基团和一个平衡基团，平衡基团也有4种相对分子量分别为31、30、29和28。其中平衡基团平衡分子量，保证与每一种报告基因结合后iTRAQ试剂总的相对分子量都是145，肽段反应基团可以同肽段的N末端和赖氨酸测量E氨基基团发生反应，这样可以标记生物样品中产生的所有肽段，增强任一给定蛋白的肽段覆盖度，同时保留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息。 2.2技术特点 该技术的主要特点在于： 1.分离能力强、分析范围广； 2.定性分析结果可靠，可同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息； 3.MS具备高灵敏度、检测限低； 4.分析时间快，分离效果好； 5.自动化程度高； 6.iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。 常用的液相色谱仪是型号是日本岛津公司2D-nano-HPLC，质谱仪型号是美国ABI公司的MALDI-TOF-TOF 4700，标记试剂盒是美国ABI公司的ITRAQ标记试剂盒。所采用的iTRAQ试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：一端是报告部分（reporter group ），另一端是肽反