普微实验之四微生物生理生化实验与接种技术2012版1.ppt

实验四 微生物生理生化实验 一、目的要求 本部分选择的四个实验，在食品的检验检测中经常使用，尤其在进行肠道菌群的鉴别检测时，常常用到这几个试验。IMVIC是吲哚试验(indol test)、甲基红试验(methyl-red test)、伏-普试验(Voges-Prokauer test)以及柠檬酸试验(citrate test)的缩写。 1、掌握吲哚试验(靛基质)的原理和方法 2、掌握甲基红试验的原理和方法 3、掌握V．P试验的原理和方法 4、掌握柠檬酸盐利用试验的原理和方法 (一)吲哚试验(indol test) 1、实验原理：有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的化合物--玫瑰靛基质。 2、实验意义：判定大肠杆菌、变形杆菌为阳性。沙门菌和志贺菌为阴性。 3、实验器材：测试菌株（大肠杆菌、沙门氏菌）、柯氏试剂、蛋白胨水培养基、乙醚、灭菌吸管、滴管 4、试验步骤： (1)前期准备：配制试管液体蛋白胨水培养基；乙醚、配制柯氏试剂。 (2)接种与培养：将测试菌接种于蛋白胨水培养基中，适温培养2-4天。 (二)甲基红试验(MR试验) 1、实验原理：M．R试验主要是测定细菌从葡萄糖产酸的能力。甲基红试验阳性的细菌先将葡萄糖分解为丙酮酸，丙酮酸再分解为甲酸、乙酸、乳酸等，其所产生的酸足以降低pH值到pH4.2或更低，并至少持续4天。甲基红阴性的细菌能够将产生的酸进-步代谢，在1天内生成中性化合物。利用甲基红作为指示剂（pH4.2-6.3）可使培养基由原来的桔黄色变为红色。 2、实验意义：用于肠杆菌科细菌鉴定。埃希氏菌属、沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属为阳性；肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性。常用于大肠杆菌和产气杆菌的鉴别，大肠杆菌为阳性，产气杆菌为阴性。 3、实验器材：测试菌株（大肠杆菌或沙门菌属）、甲基红试剂、葡萄糖蛋白胨水培养基、灭菌吸管、滴管等 4、试验步骤： (1)前期准备：配制培养液，分装试管。配制甲基红试剂。 (2)接种与培养：将测试菌接种于培养液中，适温培养2-6天。（肠道杆菌生长在37℃下以4天观察为宜） （三）乙酰甲基甲醇试验(V．P试验) 1、实验原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 2、实验意义：常与M.R实验一起使用,鉴别肠杆菌 科细菌。 3、实验器材：测试菌株（大肠杆菌）、奥梅拉试剂、贝立脱试剂、蛋白胨水培养基、灭菌吸管、滴管 4、试验步骤：（奥梅拉法） (1)前期准备：配制培养液，分装试管。配制奥梅拉试剂或贝立脱试剂。 (2)接种与培养：将测试菌接种于培养液中，适温培养2-6天。（肠道杆菌生长在37℃下以4天观察为宜） (3)贝立脱法：按每ml培养液中加入甲液（6%α-萘酚乙醇溶液）0.5ml和乙液（40%KOH）0.2ml，混合后30分钟观察，红色为阳性，有时需放置更长时间或在热水中稍加热。 V.P实验现象 （四）柠檬酸盐的利用 1、实验原理：某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为唯一碳源并利用磷酸铵作为氮源，将柠檬酸分解为二氧化碳，则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。指示剂有绿色变为深蓝色。 2、实验意义：本实验为肠杆菌科各属的-项重要鉴别特征。枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属为阳性。埃希菌属、志贺菌属等为阴性。假单胞菌、气单胞菌为阳性。 3、实验器材：测试菌株（大肠杆菌、沙门氏菌）、西蒙枸橼酸培养基、灭菌吸管、滴管 4、试验步骤： (1)前期准备：配制培养基，制作试管斜面。 (2)接种与培养：取幼龄菌种，划线接种于斜面上，适温培养2～4天。 (3)观察结果：如果培养基呈碱性(蓝色)者为阳性反应，不变色者为阴性。 二、作业 1、观察吲哚试验时为何要加入乙醚？为何要慢慢加入吲哚试剂？ 2、甲基红实验与V-P实验在反应产物上有何不同？ 3、为什么有的实验强调做对照处理？举例说明。 4、不同试验中培养基的使用有什么特点？ 三、微生物的分离、纯化及接种技术 分离与纯化： 从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。 接种： 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法 稀释涂布平板法 稀释混合平板法 平板划线法 （一）平板划线法 平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。 2、划线方法 （二）斜面接种培养技术 1、斜面接种 2、液体培养基接种 3、穿刺接种