绵羊DGAT1基因部分片段的遗传多态性分析方法的建立毕业论文.doc

PAGE 2 绵羊DGAT1基因部分片段的遗传多态性分析方法的建立毕业论文 1.前言 二酰基甘油酰基转移酶(DGAT,包括DGAT1、DGAT2和DGAT3)是参与肠道中脂肪吸收、脂蛋白组装、血浆甘油三脂(TG)浓度调节、脂肪细胞中脂肪储存、肌肉能量代谢[1]及乳脂合成、禽蛋及卵母细胞形成等的一种非常重要的微粒体限速酶。据报道[2-4],Dgat-deficient (Dgat-/-)小鼠尽管能存活,但比普通小鼠瘦弱,它可通过增加能量消耗对食物特别是高脂肪饮食诱导的肥胖症产生抗性,其组织TG水平降低,胰岛素和瘦素敏感性以及葡萄糖耐量提高,而且母鼠不能泌乳,因此DGAT基因可能是影响动物生长发育及胴体性状的重要候选基因。此外,过表达DGAT1(二酰基甘油酰基转移酶1)可减少信号脂质(二酰基甘油、磷脂酶等)而合成TG,调节膜脂质和信号脂质的合成,因而在调节细胞生长方面有重要作用[5]。有研究表明,牛DGAT1基因的一个K232A变异位点与产奶性状尤其是乳脂率密切相关,该突变可能就是该14号染色体上影响乳脂率的QTL(数量性状基因座)效应的分子机制[6-9]。目前大多研究者认为,DGAT1基因是影响牛奶乳脂率及脂肪沉积的重要候选基因,在生长发育和肉质性状等的形成中具有重要的生物学功能。 在羊上，主要的研究集中于羊的脂肪沉积和DGAT1基因的活性表达和DGAT1基因的分离鉴定表达与调控的研究是热点。大多数都采用SSCP。RFLP,RAPD等方法分析该基因的多态性，再筛选优势基因进行研究，然后进行定向诱变，加大优势基因的突变频率，产量可大幅提高。 2.实验材料与器材 2.1实验材料 本试验所用的样品为绵羊的全血，样本数量为4份，采取颈静脉采血，用肝素钠抗凝后，采样后立即编号，迅速做DNA的提取。 2.2主要仪器和设备 (1)凝胶数字成像系统：Bio-Pro型，西盟国际公司(2)电泳仪：北京六一仪器厂(DYY-1L),Biometra公司（２xT5AH） (3)电泳槽：Biometra公司 (4)PCR仪：Biometra公司 （5）微型离心机：Thermo公司 （6）电热恒温水浴锅：DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司 （7）多功能水域恒温振荡器：SHA-D型，江苏正基仪器有限公司 （8）旋涡混合仪：XW-80A型，海门市其林具而仪器制造有限公司 （9）立式电热压力蒸汽灭菌锅:LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂 （10）制冰机：SIM-F140型，SANYO公司 （11）超纯水设备：Sartorius公司 （12）可调式微量移液器：Thermo公司，编号和量程如下表： 表1试验所用的微量移液器 编号 ZX01518 ZX00732 ZX03315 ZX05185 量程（μL） 0.5-10 5-50 20-200 100-1000 2.3分子生物学与制图软件 （1）DNA STAR Lastergene（转换序列和查找序列） （2）Primer Premier5.0（引物设计） （3）Oligo（验证引物合理性） ２.４主要试剂 （1）ＤＮＡ提取试剂盒:H.Q..QDNA提取试剂盒，安徽优晶生物工程有限公司生产，组成Mu-PuDNA分离柱，2ml收集管，ZZ-I缓冲液，ZZ-II缓冲液，DNA洗涤缓冲液，DNA洗脱缓冲液，OB蛋白酶。 （2）PCR试剂盒：Fermentas公司生产 试剂盒的组成：25mmol/L10×Taq Buffer,10mmol/LdNTP ,5U/μLTaq Polymerase ,25mmol/LMgCl2。 （3）其他试剂：琼脂糖、鹏程生物 批号：Ameresco 0425 600bp ladder Maker、上海生工生物工程有限公司 批号：HF405 6×loading buffer鹏程生物 批号：Ameresco 0463 、 Tris碱 鹏程生物 批号：Ameresco 0497、 过硫酸铵 莱阳市双双化工有限公司 批号：2007.01.0924、 丙烯酰胺、西安化学试剂厂 批号：GBG75-52 去离子甲酰胺 Bio.Basic.ing公司 批号：FDB 0212-500ml、 硝酸银 西安化学试剂厂 批号：GBG70-77、 无水碳酸钠 天津正太龙化工有限公司 批号：070410、 无水乙醇 烟台双双化工有限公司 批号：2008.3.28、 TE缓冲液 上海生工生物工程有限公司 批号：SD106、 甲醛 上海中秦化学试剂有限公司 批号：2007.4.3 硼酸 天津巴斯夫化工有限公司 批号：06.11.08 3.实验设计与方法 3.1实验设计 本实验总体思路：采样→进行DNA提取→对提取的DNA进行PCR→琼脂糖电泳检测扩增产物的特异性→PAGE检测样品基因的多态