Agilent实验原理及步骤.doc

Agilent 实验原理及步骤 一、总RNA抽提（TRIzol法） 每2×107细胞加入1 ml Trizol，在旋涡震荡器上混匀；对于组织样品，每100mg组织可以加入1 ml Trizol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块。 加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1 分钟左右，室温下静置5 分钟。 4℃，12,000 rpm 离心15 分钟后小心取出上清液，将上清夜转入新的1.5 ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5 分钟。（15ml离心管用7,500rpm离心20min）） 图1 1(agrose胶电泳人胎盘总RNA (28S (18S （二）Lab-on-chip 1、胶制备 取出400μl RNA gel Matrix，加入Spinfiter柱子，离心过滤凝胶（1500(g， 10min）。 2、取出130μl过滤胶到1.5mlEppendorf管中，再加入2μlRNA Dye Concentrate，在vortexer上振荡混匀。 3、用RNA ZAP清洁操作区，同时在Electrode cleaner中加入350μlZAP，放入Lab on chip正确位置，合盖清洁探头1min。 4、再用另外一Electrode cleaner中加入350μlDEPC 处理的H2O,重复步骤3。 5、移开Electrode cleaner,让探头自然干燥。 6、取出一新的RNA Chip，吸取9μl步骤2制备的凝胶加入G 孔中。 7、将chip放置于带有活塞（plunger）的水平台上（chip priming station），将plunger拉杆向上拉倒1ml刻度出，再将chip priming station的盖子合上，压紧chip。同时向下推动拉杆至底部并维持30秒左右，松开让拉杆自动弹开。 8、从chip priming station上取出chip，用放大镜检查是否有气泡存在，如果在微通道中有气泡，需要重复步骤7。再在标有G的两个孔中各加入9μl步骤2制备的凝胶，在标有 的孔中加入5μLrna 6000 Nano Marker。同时在12个加sample的孔中滴加5μl RNA 6000 Nano Marker（不能空一个孔）。 9、取1μl RNA 6000 ladder 滴加到标有 的孔中，再各取1μl样品（RNA）加入12个样品孔中，并将chip放入IKA Vortexer上，在set-point振幅处振动1min（注意：必须卡紧chip，否则在振动过程中会跳出来）。 10、振荡好后的chip在5min之内必须放入Agilent 2100分析仪上，按照软件提示进行RNA电泳操作。 11、评价RNA质量。见（FAQ） 如图3所示，为经过Agilent 2100分析得到的完整的人胎盘总RNA。 具体操作步骤参考人cDNA表达谱芯片使用手册,SBC-H-HC-100-22，具体结果见《样品质检报告》。Lab-on-chip 参照Agilent 2100分析仪操作手册，制备凝胶，按照软件提示进行RNA电泳操作，评价RNA质量。 三、总RNA的纯化（QIAGEN RNeasy( Mini Kit） 如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGEN RNeasy( Kit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protocol。 1、取总RNA(100 μg溶解于100 μl RNase free水中，加入350 μlBuffer RLT并充分混匀。 2、加入250 μl无水乙醇，Tip头充分混匀。 3、将共计700 μl含总RNA的溶液转入套在2 ml离心管内的RNeasy 柱子内，(8000 g离心15-30sec，弃去滤过液。 4、吸取500 μlBuffer RPE到RNeasy mini 柱子内，(8000 g离心洗涤15—30sec，弃去滤过液，再用500 μlBuffer RPE在(8000 g离心洗涤2 min，弃去滤过液和2 ml的套管，将RNeasy mini柱子转入一新的1.5 mlEppendorf管中。 5、吸取 40 μlRNase free的水，(8000 g离心洗脱1 min。 6、重复步骤5一次。 四、cDNA第一链和第二链一步法合成 取2ug total RNA于1.5ml离心管中，如下配置反应溶液： 总RNA 2ug T7 Promotor primer 5ul Rnase-free Water X ul 总体积 11.5ul 65℃保温10分钟，冰浴5分钟 注意：5×First Str