TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能.PDF

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, December 25; 26(12): 1710−1716 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2010 CJB, All rights reserved. 生物技术与方法 TMD2 前断裂CFTR 翻译后的连接及氯离子通道功能 1 2 1 1 1 1 朱甫祥 ，宫贤弟 ，刘泽隆 ，杨树德 ，屈慧鸽 ，迟晓艳 1 鲁东大学生命科学学院，烟台 264025 2 Department of Physiology Biophysics, Medical college of Dalhousie University, Halifax B3H 4H7, Canada 摘 要: CFTR 基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化 (CF) 。利用split Ssp DnaB intein 的蛋白质反式 剪接技术的真核细胞双载体转 CFTR 基因，旨在研究翻译后水平 CFTR 的连接，以及由其建立的氯离子通道功能。于 CFTR 膜内第2 个跨膜结构域 (TMD2) 前的Glu838 密码子后将其cDNA 断裂为N 端和C 端两部分，与具有蛋白质反式 剪接作用的 split Ssp DnaB intein 编码序列融合，分别插入到载体 pEGFP-N1 和 pEYFP-N1 ，构建一对真核表达载体 pEGFP-NInt 和pEYFP-IntC 。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞 (BHK) ，瞬时表达实验用Western blotting 观 − 察CFTR 蛋白质的连接，并用膜片钳技术记录Cl 通道电流。结果显示，基因共转染细胞呈现完整的CFTR 蛋白条带，膜 片钳记录到全细胞Cl− − 电流和单个Cl 通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein 的蛋白质反式剪接技术可用于双载体 共转移 CFTR 基因，为CF 基因治疗应用双腺相关病毒载体 (AAV) 转运CFTR 基因，克服AAV 的容量限制提供了依据。 关键词: CFTR ，Cl−通道，split Ssp DnaB intein ，蛋白质反式剪接，双载体基因转移 Post-translational ligation of split CFTR severed before TMD2 and its chloride channel function 1 2 1 1 1 1 Fuxiang Zhu , Xiandi Gong , Zelong Liu , Shude Yang , Huige Qu , and Xiaoyan Chi 1 College of Life Science, Ludong University , Yantai 264025, China 2 Department of Physiology Biophysics , Medical College of Dalhousie University , Halifax B3H 4H7, Canada Abstract: Mutations of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene leads to cystic f