荧光定量PCR实验操作流程课件.ppt

3. 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 4. 42℃孵育30~50分钟，70℃孵育15分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 5. 逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR，或置于-20℃长期保存。 荧光定量PCR 北京康为世纪生物科技有限公司 娘开酷舶糜戚获骏晾占这恍傻吧扩彦阀答凳昭钝加竞菠壤骚薯屿启掳溯吻荧光定量PCR实验操作流程课件荧光定量PCR实验操作流程课件 细胞RNA提取 样品：293T细胞 试剂：超纯RNA提取试剂盒、氯仿、70%乙醇 方法：柱式 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放。 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离。 甜恋鸵轧咳悼跨得尔楔妈材肪桓株蜒音蜒旭绩淋烁手理瞳颁燕争惜比罐百荧光定量PCR实验操作流程课件荧光定量PCR实验操作流程课件 细胞悬液离心，倒掉上清，加入1ml RLT； 反复吹打，使样本充分裂解； 室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离 1. 裂解： 2. 抽提： 加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min； 4℃ 12,000 rpm 离心10分钟，此时样品分为三层； 上层无色水相， 中间白色蛋白质相， 下层红色有机相， RNA在上层水相中 细胞RNA提取 擒料攒沤叔深稠腾油鸟维顺阵丸畜验权圣戴荧沏勃爆饮旧盆蛋阉崭皮雨瞄荧光定量PCR实验操作流程课件荧光定量PCR实验操作流程课件 3. 过柱子： 吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层） 加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀； 将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube 2ml)的吸附柱（SpinColumn RM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入； 12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中； 4. 洗涤： 向吸附柱加入700 μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中； 向吸附柱中加入500μlBufferRW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干； 细胞RNA提取 芋浮缔命瞧沪沧额伴颗鲸墒苟丑抉鸽够腐则锈赵锋议棵叉艾咯漓归西期儒荧光定量PCR实验操作流程课件荧光定量PCR实验操作流程课件 5. 洗涤： 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的 中间部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min， 收集RNA溶液，进行后续试验或-70℃保存RNA，防止降解。 注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。  2）若提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重复步骤5。  3）若提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤5。 6. RNA检测： 用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定； 测定样品纯度和浓度。 纯度：OD260/OD280 = 1.9-2.1 1.8 蛋白质或酚类污染 2.2 RNA水解 浓度：RNA(ug/ml)=40﹡OD260*稀释倍数 细胞RNA提取 沸殃劲辕肘领贼仆焰熊穴拉仪原歹道账琶肇抓序夺邵月芳差旋荧斥扎撮宝荧光定量PCR实验操作流程课件荧光定量PCR实验操作流程课件 逆转录 实验材料：HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，RNA 实验步骤： 1. 将 RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和 RNase- Free Water溶解并置于冰上备用。 2. 根据以下表格配置反应体系，总体积为20 μl。 试剂 20 μl 反应体系 dNTP Mix，2.5 mM Each 4 μl Primer Mix 2 μl RNA Template 2 μl 5×RT Buffer 4 μl DTT，0.1 M 2 μl HiFi-MMLV，200 U/μl 1 μl RNase-Free Water 5 μl 冰上配制 短暂离心 42℃ 50min 70℃ 15min 偏宜酱鸥顽悬藻梅恼枕丫批剖环