四试验步骤.PPT

《动物遗传学》实验 山东农业大学动科学院 主讲：姜运良 实验一 果蝇唾液腺细胞的染色体 一 实验目的 练习果蝇唾液腺的分离方法 掌握唾液腺染色体的制片技术 观察唾液腺染色体的特点 二 遗传物质发现的历史 19世纪60年代——孟德尔定律（遗传单位） 19世纪80年代——染色体 1903年——同源染色体 1909－1911年——交换 or 遗传重组 1911年——染色体图谱 1944－1952年——DNA（遗传物质） 1953年——DNA双螺旋 三 实验原理 1933年，美国德州大学的Thoephilus painter在某些昆虫细胞中发现了巨大染色体 双翅目昆虫（果蝇）幼虫期的唾液腺细胞很大，其中的染色体称唾液腺染色体，比一般的普通染色体的100－150倍，又称巨大染色体。 在幼虫发育过程中，这些细胞停止有丝分裂，但唾液腺染色体仍然进行复制，产生多线染色体。 多线染色体经染色后，出现深浅不一、宽窄不同的带，这些带的数目和位置是恒定的，代表着果蝇等昆虫的种的特征。如果染色体缺失、重复、到位、易位等，很容易在唾腺染色体上识别出来。 四、实验材料和用品 实验材料 黑腹果蝇的三龄幼虫 实验用品 显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸。 E－生理盐水、 1％醋酸洋红。 五、实验步骤 载玻片置于显微镜下，上面滴加一滴生理盐水，放上果蝇幼虫，两手各拿一枚解剖针，左手解剖针按住幼虫的后端1/3, 右手解剖针按住头部用力后拉，把头部从身体拉出，唾液腺随之而出。（一对双叉形透明的囊状腺体）。 除去幼虫其他组织部分，把唾液腺周围的脂肪剥离干净，然后将唾液腺移到干净的滴有醋酸洋红的载玻片上。 五、实验步骤 染色10 分钟，盖上盖玻片，用滤纸轻压一下吸去多余的染色液后放在桌子上，用大拇指用力，并横向揉几次（勿使盖玻片移动）。 显微镜观察，先在低倍镜下观察，找到分散好的染色体图像，再高倍镜观察，画图。 载玻片滴生理盐水→放幼虫→用解剖针将头部和身体拉开→找到唾液腺并将其剥离干净→转移到有一滴醋酸洋红的载玻片上→10min→盖盖玻片→压片→观察 六： 作业 实验报告 分组值日 显微镜放回原位 实验二 PCR扩增和琼脂糖电泳检测 一、实验目的 学习和掌握PCR扩增及琼脂糖电泳的基本原理和方法。 二、实验原理 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧设计寡核苷酸引物，经变性（94℃）、退火（45~68℃）和延伸（72℃）若干个循环后，DNA扩增2n倍。 所使用的酶为耐热的DNA聚合酶（Taq酶）。琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1→3）和β（1→4）糖苷键交替构成的线状聚合物 根据浓度的不同，琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。将DNA加到凝胶的负极，在电场的作用下，将不同大小的片段分开 三、仪器、材料与试剂 仪器 PCR热循环仪 琼脂糖凝胶电泳及检测系统 材料与试剂 鸡基因组DNA dNTPs（10mmol/L） 上下游引物（浓度10μmol/L） rTaq酶（5U/μL） DL2000 DNA Marker MgCl2（25mM） 10×PCR缓冲液 灭菌双蒸水 1.5%琼脂糖（含EB，注意致癌） 电泳缓冲液，上样缓冲液。 四、实验步骤 PCR扩增 反应体积（20μl），在0.2ml Eppendorf中依次加样： 10×PCR buffer 2.0μl MgCl2 1.6μl dNTPs 1.6μl 上游引物 0.5μl（10μmol/L） 下游引物 0.5μl（10μmol/L） DNA 1.0μl ddH2O 12.6μl rTaq 0.2μl 四、实验步骤 PCR扩增 反应条件： 94℃ 3min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 40s（循环28次），72℃ 10min在PCR扩增仪上进行扩增。 四、实验步骤 琼脂糖凝胶电泳 配制1.5%琼脂糖凝胶，取5μl PCR扩增产