人脐静脉内皮细胞的分离和体外培养第三军医大学基础部中心试验室.docVIP

人脐静脉内皮细胞的分离和体外培养 第三军医大学基础部中心实验室 张晓庆 【摘要】目的　建立一种能大量分离和体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便、高效易行的方法。方法　采用0.1%的胶原酶消化HUVEC 12-15min，用RPMI-1640＋10％FBS培养基体外培养HUVEC,显微镜下观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。　结果　采用0.1%的胶原酶消化能分离出HUVEC,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好, 培养3d左右细胞可达到融合状态。 结论　胶原酶消化法是一种高效、易行、操作简便的分离、培养HUVEC的方法,细胞获得量较多且生长状态良好。 【关键词】细胞培养技术；人脐静脉；血管内皮细胞 Disassociation and Primary Culture of Human Umbilical Vein Endothelial Cells 【Abstract】 Objective 　To establish a technique for disassociating and culturing human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) in vit ro. Methods　Fresh HUVEC from human umbilical cords were perfused by 0.1% concentrations of collagenase and digested for 12-15min. The morphology , numbers and fusion of cultured cells were examined by light microscopy. Results 　Digestion with 0. 1 % collagenase and incubation for 12-15 min were the best conditions for culturing cells. The cells grew to form confluent monolayers of polygonal cells within 3d. Conclusion 　The digestion using collagenase is simple and successful for collection of HUVEC. 【Key words】cell culture techniques; human umbilical vein; vascular endothelial cells 血管内皮细胞位于血管内壁,现在认为它是一个活跃的“内分泌器官”,具有许多生物学功能，参与了机体许多生理病理变化过程,是许多疾病(如肿瘤血管生成等)发生的始动机制。因此研究内皮细胞的功能及在疾病中的作用,可以从细胞分子水平进一步探讨疾病发生的本质,为治疗和预防疾病提供新的思路。为此,体外培养人体内皮细胞已成为完成科研任务的一个重要手段。新生儿脐带来源丰富,取材方便,目前已成为血管内皮细胞体外实验的的重要材料。在实验中,逐步摸索人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)在体外培养的适宜条件,以确定HUVEC体外生长繁殖的最佳环境,为进一步进行相关研究提供实验材料。 1 　材料和方法 1.1 　材料 1.1.1 　D-hank液的制备　NaCl 8g, KCl 0.4g,Na2HPO4·12H2O 0.12g, KH2PO4 0.6g,NaHCO3 0.35 g,先用800mL三蒸水溶解,调至pH 7.2-7.4,加水定容至1000mL,在151bf/in2(1.034×105Pa) 高压蒸汽灭菌20min,分装后4℃保存备用。 1.1.2 　胶原酶　0.1g胶原酶(Ⅱ型,Sigma)溶于100mL D-hank液中,使其浓度为0.1%,置室温搅拌4h充分溶解,4℃过夜,抽滤后分装,4℃保存备用。 1.1.3 　RPMI-1640完全培养基　1640粉(GIBCO)10.4g,L-谷氨酰胺0.292g,Hepes 2.3831g,青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL,20%FBS(胎牛血清,HyClone公司),三蒸水1000mL,pH 7.2-7.4,抽滤后分装,4℃保存备用。 1.2 　人脐静脉内皮细胞的分离、培养与观察　在无菌条件下,取正常分娩或剖腹产胎儿脐带(患者知情并签字同意),挤出脐带血管中的血液, 放入冷的无菌D-hank液中,3-6h内进行脐带静脉内皮细胞培养。剪去有钳子夹痕和血肿、凝血块阻塞的部分。在超净台中找到一端脐静脉口,插入自制的连