1 常规PCR实验课件.ppt

常规PCR技术和琼脂糖凝胶电泳 ; 掌握： 1、PCR的基本操作方法。 2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的基本原理和方法。 理解： 1、PCR仪的使用方法。 了解： 1、PCR体外扩增的原理及其引物设计原则。 2、扩增过程中各因素对扩增结果的影响。;1、PCR反应体系的建立。 2、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。;一、基本原理;;Cycle 2;Cycle 3;琼脂糖凝胶电泳原理;二、操作步骤;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶(如Taq酶) dNTPs 反应缓冲液（含Mg2+）;;PCR反应程序的设计（难点） 预变性： 94℃ 5 min 变性： 94℃ 30 sec 退火： 55℃ 30 sec 延伸： 72℃ 40 sec(60 sec) 最终延伸： 72℃ 5 min 保存： 4℃ for ever;PCR程序设计的主要因素;主要实验仪器; ;实验步骤三：结果检测;不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围 ;3. 上样 反应结束后取5μL反应产物，加入1μL上样缓冲液（6×loading buffer），用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 指示剂：溴酚蓝 Marker：DL2000。 注意： 加样孔位于负极，DNA由负极向正极泳动;4. 电泳 电泳100 V，10 min左右。;三、注意事项;四、影响PCR反应的因素;3、引物(引物的好坏是整个PCR反应的关键) 引物浓度一般为0.1～0.5mmol/L，浓度太高，会增加非特异性扩增，形成引物二聚体；浓度太低，影响扩增效率和产率。 *引物设计的原则 长度15 ～ 30bp GC含量45 ～ 55% 两条引物退火温度一致或接近，Tm差值小于5℃ 无连续核苷酸 引物内部及引物间无互补，以免形成发夹结构和引物二聚体;特异性的引物：特异性的产物;4、Mg2+浓度 Mg2+是DNA聚合酶发挥作用的必须成分； 最适浓度一般为0.5-2.5mmol/L,浓度过低则无法启动反应，过高则影响产物特异性。 ;5、Taq DNA聚合酶 具有5’→3’DNA聚合活性外，还具有5’→3’DNA外切活性。因此，在某些时候可选择具有校读活性的聚合酶例如Pfu； 可以根据需要选择扩增长片段的Taq酶，高速扩增的Taq酶等 反应终浓度以2～2.5 U/100μl为最佳 ;五、问题分析;问题1：无扩增产物;纯度：含有抑制物 浓度：含量低 质量：全长 结构：二级结构 ;引物错误 引物设计不好 引物降解 引物合成、纯化不好;退火温度 延伸时间 循环次数; 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带;引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多; 靶序列或扩增产 物的交叉污染。 ;Thanks your attention！