一种纳米抗体稳定课件.ppt

一种纳米抗体稳定的β2肾上腺素受体活跃状态的结构 Structure of a nanobody-stabilized active state of the b2 adrenoceptor 摘要 G蛋白藕联受体在对天然的和人工合成的配体的反应中显示了一定范围的功能行为。近期的晶体结构为几个G蛋白偶联受体的不活跃状态提供了洞见。努力获取一种激动剂结合的活跃状态的GPCRS结构已经证明是很困难的，因为在不存在G蛋白时的这种状态的固有的不稳定性。我们合成了一种针对人类β2肾上腺素受体的骆驼抗体片段（纳米抗体），它显示了G蛋白一样的行为，并且获得了受体—纳米抗体复合物的一种激动剂结合的活跃状态的晶体结构。和不活跃状态的β2AR结构的比较显示了在结合位点的微小变化。然而，这种微小变化和跨膜片段6胞浆终点的11A外向运动以及跨膜片段5和7的重排相关联，这和在视蛋白，一种活跃形式的视紫红质中观察到的非常相似。这种结构为激动剂结合和活化过程提供了洞察。 该论文的结构 第一部分：对G蛋白偶联受体和 其相关蛋白的介绍 第一段：GPCRS的不同效力的激动剂和拮抗剂。 第二段：一种GPCR---视紫红质的两种状态：结合视黄酮的非活性状态和光敏感的活性状态。 第三段：β2AR 活跃转台的稳定需要激动剂和Gs,和Gs的代替物。 第二部分；纳米抗体稳定的β2AR的活跃状态 第四段：纳米抗体Nb80的获得。 第五段：Nb80和Gs对β2AR结构和激动剂结合亲和力的效果 的比较。 第六段：Gs和Nb80对β2AR在激动剂亲和力上的效果 第七段； 高分辨率的β2AR非活跃状态的结构的获得。 第三部分；高亲和力的β2AR激动剂--——BI-1167107. 第四部分： β2AR—T4L—Nb80复合物的结晶。 第五部分；激动剂稳定的β2AR的结构改变 关于arrestin的生物作用其本质是一种视黄铜蛋白（这将与第二段有关） 在第二段中有关蛋白的关系 G蛋白偶联受体：视蛋白、视紫红质蛋白 有七个跨莫螺旋结构 视蛋白+视黄酮=视紫红质蛋白 光激活的生色团 11-顺-视黄酮 传递G蛋白（Gt-transducin） 配体激活的人类β2AR一种非光而是配体激活的G蛋白偶联受体 Unlike the activation of rhodopsin by light, agonistsare much less efficient at stabilizing the active state of the b2AR,makingit difficult to capture this state in a crystal structure. 用一个被构象敏感荧光针标记的β2AR所做的实验显示活跃状态的稳定需要激动剂和兴奋性G蛋白（Gs）——对腺苷环化酶起激活作用的G蛋白---的共同作用。 激动剂+GPCR+G蛋白---生物效应 努力获得激动剂--GPCR--G蛋白复合物是非常重要的；然而，这是一个特别困难的努力因为在对GPCR和G蛋白同时作用时的生物化学上的挑战，和在清洁剂中这种复合物固有的不稳定性。 作为一条另选途径，我们合成了一种优先地结合并稳定活性构像的结合蛋白，作为兴奋性G蛋白（Gs）的代替品。 Gs(兴奋性G蛋白）的代替物是什么？！--Nanobody（纳米抗体） 我们识别出了对β2AR展示了像G蛋白一样行为的骆驼抗体片段--Nanobody 。 骆驼亚目(双峰驼、单峰驼、无峰驼）已经形成了一类独特的缺乏轻链的功能抗体分子。 一个纳米抗体是这样一个骆驼重链抗体的重组的最小型号的完整抗原结合域，并且它大约只有常见Fab片段25% β2AR的大小。 为了合成受体专一的纳米抗体，一个无峰驼用在高浓度下被重组成磷脂囊胞的被纯化的激动剂结合的β2AR免疫。 由此一个单链纳米抗体克隆文库被组建成并用激动剂结合的受体筛选。 我们鉴定出七种能够识别激动剂结合的β2AR的纳米抗体克隆。在这些克隆抗体中，Nb80被选出因为当它结合到野生型β2AR和β2AR-T4L时展示了像G蛋白一样的特性。 β2AR-T4L是β2AR-T4溶菌酶融合蛋白用来获得高分辨率的不活跃状态的晶体结构。 如何比较了Nb80和Gs对β2AR结构和激动剂结合亲和力的效果 ?? β2AR用荧光团monobromobimane（一种杂环化合物）在跨莫蛋白螺旋6胞浆终点的265赖氨酸处被标记并被重组成高密度脂蛋白微粒。 Bimane monobromobimane (mBBr) Bimane is a heterocyclic chemical compound. Bimane forms the core of a class of fluorescent dye