动植物细胞器离心法分离.ppt

实验4 动植物细胞器分离、制备与观察 I 线粒体制备与活性鉴定 【目的】 1．掌握分离制备动物和植物细胞线粒体的方法。 2．对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 【原理】 线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。 将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。 细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动、植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料(碱性染料)的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染部分本身具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆集下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞的死亡。 鼠肝线粒体的分离 【材料】 鼠肝脏或猪肝脏。 【实验用品】 1．试剂： (1) 0.25 mol／L蔗糖+0.01 mol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)一盐酸缓冲液(pH 7.4)： 0.1 mol／L三羟甲基氨基甲烷溶液 10 mL 0.1 mol／L盐酸 8.4 mL 加双蒸水到100 mL，再加蔗糖使浓度为0.25 mol／L。 (2) 0.34 mol／L蔗糖+0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液(pH7.4)，配法同上。 (3) 1％詹纳斯绿B(Janus green B)染液，称取50 mg詹纳斯绿B液溶于5mL生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为1％原液。 (4) 姬姆萨染液(Giemsa)： 称取Giemsa粉0.5 g、甘油33 mL、纯甲醇33 mL。先在Giemsa粉中加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒入混匀，56℃左右保温2 h，使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕色瓶。使用时吸出少量用1／15mol／L磷酸缓冲液作10~20倍稀释。 (5) 1／15 mol／L磷酸缓冲液 (pH 6.8)： 1／15 mol／L磷酸二氢钾(KH2PO4) 50 mL 1／15 mol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 50 mL (6) 卡诺(Cornay)固定液： 无水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL (7) 生理盐水 2．器具： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。 【实验步骤】 1．制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织2 g，剪碎；用预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5 mL预冷的0.25 mol／L蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。 2．差速离心： 将0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。 分离细胞核： 鼠肝匀浆700×g离心10 min 沉淀(细胞核及质膜碎片) 上清液(1) 洗涤(0.25 mol／L预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次，每次1000×g离心15 min。 沉淀(细胞核及质膜碎片) 上清液(2)→与上清(1)合并 分离线粒体： 混合上清液10000×g离心10 min 沉淀(线粒体)