实验5 离心柱法胶回收和连接.docx

胶回收（离心柱法）实验步骤1．将切下胶块放入干净的1.5ml EP管中，称重，以确定胶条的体积。若凝胶重为0.1g，其体积可视为100 μl，则加入100μl PC溶液。2.向胶块中加入等倍体积溶液PC，50℃水浴放置10min，不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如有未溶胶块，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解。3. 柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温/潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响。）4. 将上述第2步所得溶液加入平衡后的吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。5. 向吸附柱CB2中加入600 μl漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。6. 重复操作步骤57. 将吸附柱CB2放回收集管中，12,000 rpm 离心2 min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，防止残留漂洗液影响下一步实验。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。8. 将吸附柱CB2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40ul洗脱缓冲液EB，（如果回收的目的片段4 kb，则洗脱缓冲液EB应置于65-70℃水浴预热），室温放置2 min。12,000 rpm 离心2 min收集DNA溶液。注意：洗脱体积不应小于30 μl，体积过少影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液(10 mMTris-Cl, pH8.0) 洗脱。9. 为了提高DNA的回收量，将步骤8离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。DNA分子的体外连接实验步骤取新的1.5ml离心管，加入实验反应体系，如下：线性化载体pCDNA3（大片段） 5 μL（~0.1 μg）目的基因p38片段（小片段） 12 μL10*buffer 2ulT4连接酶 1ul（由老师加）总体积 20ul盖上管盖，混匀，台式离心机上离心５秒。室温连接1小时。感受态制备及转化1、每小组取3ml培养液12000rpm离心1min，弃上清；2、加入3ml 冰预冷的0.1M CaCl2重悬沉淀，12000rpm离心1min, 弃上清；3、重复步骤2一次；4、加入100μl 0.1M CaCl2重悬沉淀，分成两管置于冰上；5、上述一管加入10μl连接质粒作为实验组，另一管加入5ul酶切片段（大片段或者小片段）作为阴性对照，做好标记，置于冰上30min;6、将离心管置于42 ℃水浴90s，迅速置于冰上2分钟；7、于超净工作台加入500 μl LB培养基， 37℃，180rpm培养40min;8、12000rpm离心1min, 弃上清450μl，余100μl重悬沉淀9、涂布于Amp抗性平板上，做好标记，倒置培养皿放入37℃培养过夜；第二天观看实验结果要求：将实验结果通过手机或者相机拍下，打印作为实验报告的结果图用枪头将培养皿中的培养基刮到垃圾桶中，不能刮到水槽中，以免造成水槽堵塞将培养皿清洗干净，皿上做的标记要洗掉将洗干净的培养皿放到仪器室实验台的白框中