实验5.动物细胞融合实验.ppt

实验五 动物细胞融合实验 生命科学学院 细胞生物学实验 一、实验目的 了解聚乙二醇（PEG）诱导鸡血细胞融合的基本原理。 通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合试验，初 步掌握细胞融合的基本方法。 二、实验原理 细胞融合（cell fusion）指在自然条件下或用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。 人工诱导的细胞融合不仅能进行同种细胞融合，也能进行种间细胞融合。因此，细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如制备单克隆抗体、研究细胞遗传育种等。 细胞融合的诱导物种类很多，常用的主要有灭活的仙台病毒、聚乙二醇和电脉冲。 聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是乙二醇的多聚化合物，相对分子质量在200-6000均可用作细胞融合剂。 PEG 可借氢键与水分子结合，在高浓度(50％)的 PEG 溶液中自由水消失，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化， 进而使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，从而使细胞发生融合。 选择合适的分子量、浓度及作用时间是 PEG 融合技术的关键。 三、实验用品： 试剂: Alsever 溶液、 0.85％生理盐水、GKN 溶液、 吉姆萨染液、 50％PEG（WM=4000）溶液、Hank’s原液（10×） 材料: 鸡红细胞悬液（课前制备） 器材：血球计数板、滴管、离心管、烧杯、注射器、凹玻片、盖玻片。 设备：离心机、显微镜、天平、水浴锅 四、实验方法与步骤： 5. 融合 待温度恒定（2-3min）后，吸取0.5ml 50％PEG溶液，慢慢沿离心管壁流下，且边加边轻摇离心管，使细胞与PEG混匀，然后放入水浴锅中。 39℃水浴条件细胞融合20～30min后，加入Hank’s液至 8ml，静置于水浴锅中 10min ，中止PEG作用。 取出离心管，1000r/min 离心 5min，使细胞完全沉降。弃去上清液，加Hank’s液 5ml重悬细胞，再离心 1 次。 6.染色 弃去上清液，加入0.5ml GKN溶液，手指轻弹离心管底使细胞团混匀。取未融合和融合的细胞悬液各1滴于双凹载玻片上，加入吉姆萨染液1小滴，用牙签搅匀，3min 后盖上盖玻片，显微镜下观察细胞融合情况。 五、注意事项： 影响细胞融合的因素很多，其中对 PEG 的要求更严格。实验时最好选择分子量在 1500～6000，PEG 的浓度以 50%为好。 细胞融合对温度很敏感，过高过低的温度均不利于融合。实验最佳温度应控制在 37℃～39℃范围内。 pH 也是影响细胞融合成功与否的关键因素之一。所配的试剂溶液 pH 值应控制在 7.0～7.2。 为了便于观察到细胞融合的形态，需要对细胞进行染色，可选择HE 染色或姬姆萨染液。 加入Hank’s液后，在水浴锅中静置10 min 左右以中止PEG作用。 六、作业及思考： PEG诱导鸡红细胞融合后，绘图显示观察到哪几种类型的细胞。 PEG用于细胞融合实验至少有哪两方面的作用? 1. Alsever 溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，柠檬酸 0.05g，溶于100ml双蒸水中。 2. 0.85％生理盐水：取0.85gNaCl，溶于100ml双蒸水中。 3. GKN 溶液：NaCl 8.0g，KCl 0.40g，Na2HPO4?2H2O 1.77g，NaH2P04.H2O 0.69g，葡萄糖 2.0g，酚红 0.01g，溶于 1000ml 双蒸水中。 4.50％PEG 溶液：称取一定量的PEG（WM=4000）放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混匀，置37℃备用。 5.Hank’s原液（10×）： NaCl 80.0g Na2HPO4·12H2O 1.2g KCl 4.0g KH2PO4 0.6g MgSO4·7H2O 2.0g 葡萄糖 10.0g CaCl2 1.4g ①称取1.4g的CaCl2 ，融于30-50ml的重蒸水中。 ②取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后，方可加入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl２溶液加入，最后加水至1000ml。