第4章 色谱分析法.ppt

Enter presentation date 第五章 凝胶过滤层析 Test 第四章 高效液相色谱法及其应用 第一节 概述 4.1.1 史程、专用术语 1906年由俄国植物学家Tsweet创立植物色素分离（见图示） 现在：一种重要的分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析 术语 固定相——除了固体，还可以是液体 流动相——液体或气体 色谱柱——各种材质和尺寸 被分离组分——不再仅局限于有色物质 4.1.2 色谱分离过程和类型 溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的分配过程，是借助各组分的物理化学性质的差异而进行分离。 分类：可分为吸附色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱、亲和色谱、反相色谱等。 4.1.3 色谱流程和仪器 4.1.4 HPLC的特点和优点 “三高” “一快” “一广” 高柱效，柱子可反复使用 高灵敏度：10-7g；10-12g 高选择性（分辨率高） 分析速度快：10～30min 应用范围广泛（可分析80%有机化合物），样品容易回收。 第二节 基本理论 4.2.1色谱分离过程 4.2.1.1液固吸附色谱法（LSC） 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分。 在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。 4.2.1.2 液-液分配色谱 一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。 以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为正相分配色谱，适合于分离极性化合物； 如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配色谱， 正相色谱法　采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法　一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。 4.2.1.3 离子交换色谱 离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。 固定相→离子交换树脂 流动相→水为溶剂的缓冲溶液 被分离组分→离子型的有机物或无机物 4.2.1.4 离子对色谱 样品在水溶液中可解离为带电荷的离子，若向其中加入相反电荷的离子，形成中性的离子对，增大其在非极性固定相中的溶解度，增加分配系数，改善分离效果。 分离碱类物质常用离子对试剂烷基磺酸盐 分析酸类物质常用四丁基季铵盐 常用ODS柱，流动相为甲醇-水或乙腈-水中加入3～10mmol/L的离子对试剂。 4.2.1.5 分子排阻色谱法 固定相→多孔性填料（凝胶） 流动相→溶解样品的溶剂 基于样品相对分子量大小不同而对样品进行分离的色谱法。 相对分子量大的化合物先从柱中洗脱。 常用于分离高分子化合物或复杂的物质。 国外 国内 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 2．进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5-30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 3 分离系统——色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm。 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技术的性能不受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 4．检测系统 HPLC与GC一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度