第4章 蛋白质一级结构测定.ppt

蛋白质构象的确定 Ⅰ. X 射线结晶（X- Ray Crystallography） Ⅱ. 冷冻电镜术（Cryoelectron Microscopy） Ⅲ. 核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR） Ⅰ. X 射线结晶（X- Ray Crystallography） ?X 射线波长很短（0.01 ~ 10 nm）。用于结构分析的是单色 X 射线 ? X 射线照射绕晶轴旋转的蛋白质结晶，产生许多衍射线。用照相底片等方法记录，便得到了许多衍射图 ?测定衍射图上各个衍射斑点的位置和强度及重原子在重原子衍生物中的位置，用同晶置换法解出蛋白质晶体的衍射相角 ?计算并绘制蛋白质分子的电子密度图，参照蛋白质的一级结构和二硫键信息，解出蛋白质分子的构象 X 射线结晶（X- Ray Crystallography） 测定衍射斑点位置和强度 X 射线照射绕晶轴旋转的蛋白质结晶，产生许多衍射线用照相底片等方法记录，便得到了许多衍射图 衍射斑点的位置和强度及重原子在重原子衍生物中的位置，用同晶置换法解出蛋白质晶体的衍射相角 计算并绘制蛋白质分子的电子密度图 参照蛋白质的一级结构和二硫键信息，解出蛋白质分子的构象 Ⅱ. 冷冻电镜术（Cryoelectron Microscopy） ?蛋白质样品在液氦中快速冷冻以保存其结构。 ?用冷冻电镜测定蛋白质在冷冻和水合状态下的结构。 ?在胶片上记录图象时，用低剂量电子以防止射线破坏蛋白质结构。 ?软件分析图象并重构蛋白质三维结构。 ?产生的分子模型的质量可以与 X 射线媲美，而且比 X 射线分析节省人力和物力。 结合 RNA 的 snRNPs 例一 脊髓灰质炎病毒颗粒（poliovirus particle） a：没结合受体，圆形 b、c、d：结合了受体后，有很多突起 例二 Ⅲ. 核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR） ?限于 20 Kda 以下的蛋白质。 ?将浓缩的蛋白质溶液放入磁场中，测出不同原子的共振频率。 ?每一个原子共振频率都受相邻原子的影响，而且离得越近，影响越大。 ?放大这种效应，就能测出氨基酸残基间的距离，用于产生蛋白质的三维结构模型。 ?也可用于蛋白质结构域分析。 E .coli 外膜蛋白 A 的跨膜结构域 a：NMR 产生的结构 b：带子模型 c：NMR 产生的结构 与 X 射 线衍射图 （蓝色）比较 实例 蛋白质的检测 一、 抗体检测法 二、Western Blotting 三、放射性同位素标记法 一、抗体检测法 ?多抗（polyclonal antibodies, 通常以抗血清的形式存在）是指不同种类抗体的混合物，能识别一个大分子抗原中的多个抗原决定簇（epitopes）。 ?单抗（monoclonal antibodies）指的是同种抗体，识别大分子抗原上的特定抗原决定簇。 ?单抗由一定数量的相同细胞产生。这些细胞来源于同一个杂交瘤细胞（hybridoma）。 ?抗体可以检测表面只相差一个残基的蛋白质。 ?借助特殊的分析试剂可对蛋白质进行精确定量。 抗体检测法 ?两级抗体：一抗（primary antibody）和二抗（secondary antibody）。一抗与特异的抗原结合，二抗与酶偶联，然后结合到一抗。 ?酶（如碱性磷酸酶，alkaline phosphatase）作为标记物，催化无色物质生成有色物质。 ?抗原要进行包被，使其能牢固地吸附在固相载体表面，并保持免疫活性。 ?没有吸附抗原的地方用非特异性蛋白覆盖。 ELISA— enzyme-linked immunosorbent assay ELISA ELISA 结果 二、Western Blotting ? 灵敏度高，用于检测极微量的蛋白质 （Find a needle in a hastack . 大海捞针） ?与 SDS、antibody、enzyme 联合使用 Western Blotting 三、 放射性同位素标记法 ?放射性同位素的掺入不影响分子的性质。 ?根据实验目的和放射性同位素的特征（如半衰期、放射产生的能量及能否进入细胞等），选择合适的同位素进行标记。 ?放射自显影（autoradiography）用感光材料进行感光，如 X 光胶片，液体乳胶。然后用肉眼或显微镜观察，能半定量。 ?放射性同位素的定量测定用计数器（counter），如盖革计数器（Geiger counter）、液闪计数器（scintillation counter）。 ?确定生物大分子在细胞内