第4章 高效液相色谱.ppt

HPLC是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从以下两方面进行比较： 分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min。 对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约1.7m，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用HPLC法，只需lh之内即可完成。 用25cm×0.46cm×5um的Lichrosorb-ODS柱，采用梯度洗脱，可在30min内分离出尿中104个组分。 由于HPLC所用固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、过滤器、高压输液泵、压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是核心部件。 对于一个好泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。 液相色谱柱比气相色谱柱短得多，所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。 进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此HPLC中对进样技术要求较严。 原理：根据物质具有紫外-可见吸收的特性 液液分配色谱（LLPC） 液固吸附色谱（LSAC） 离子交换与离子色谱（IEC与IC ） 离子对色谱（IPC） 体积排阻色谱法（SEC） 亲和色谱（AC） 在分配色谱中，流动相和固定相都是液体，适用于各种样品类型的分离分析，无论是极性和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型和非离子型的化合物。 由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。 为更好解决固定液在载体上的流失问题，产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 为了避免固定液的流失，对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相色谱和反相色谱。 采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱相反。 采用化学键合固定相的液相色谱称为化学键合相色谱，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。 由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。 键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基（Si-OH）与有机分子可成键的特性。一般可分三类： （1）疏水基团 不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基 （2）极性基团 氨丙基、氰乙基、醚和醇 （3）离子交换基团 阴离子交换基团的胺基、季镀盐；阳离子交换 基团的磺酸 键合固定相的优点与缺点 通过改变流动相的组成和种类，可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。 由于键合到载体上的基团不易流失，特别适用于梯度洗脱。 据统计，在HPLC法中，约有80％的分离问题是用键合相色谱法解决。 最大缺点是不能用于酸、碱度过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的体系。 液固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。 多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。 为一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。 下表列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的ε0值。在硅胶吸附剂中ε0值的顺序相同，数值可换算（ε0硅胶=0.77×ε0氧化铝）。 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离。 利用不同待测离子对固定相亲和力的差别。固定相采用离子交换树脂，其上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换。 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）： 离子交换