定量PCR步骤课件.ppt

3、定量PCR的试验操作过程 ;Real Time PCR方法的选择;;探针荧光标记物选择;Realtime理论操作过程;样本RNA;RT primer的选择;Realtime PCR引物和探针的设计;; 好的引物需要 寻找好的参照序列;Realtime PCR用TaqMan探针设计原则;相对效率曲线;线型关系、扩增效率确认 相关系数(r2)：大于0.98 PCR扩增效率(E):0.8-1.2;Realtime应用实例;绝对定量;绝对定量流程;绝对定量;绝对定量;绝对定量;相对定量;相对定量流程;维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18S rRNA等。;;相对定量应用实例分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化 ;由以上结果显示小鼠某 基因经药物处理6小时 时表达量最高;4、定量PCR的数据处理 ;绝对标准曲线法;生物学方面的误差：IPC校正 细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等 物理方面的误差：ROX校正 枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不??致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等 其余的误差：统计校正 重复实验，取平均值;4.2 相对定量的数据处理;相对标准曲线法;生物学方面的误差：IPC校正 细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等 物理方面的误差：ROX校正 枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等 其余的误差：统计校正 重复实验，取平均值;Xn=X0×(1+Ex)n Ex=ER Folds=2 –ΔΔCt ΔΔCT =(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4) Ct1:处理样品待测基因的临界循环数 Ct2: 处理样品持家基因的临界循环数 Ct3: 对照样品待测基因的临界循环数 Ct4: 对照样品持家基因的临界循环数