第二章_沉淀分离技术.ppt

3.其他化学因子 甲酸、乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、甲醇、乙醇、表面活性剂如十二烷基磺酸钠SDS等 * 3.蛋白质变性后性质的改变 1.生物活性丧失 酶、激素、毒素、抗原性等丧失 2.物理化学性质改变 溶解度下降、粘度增加、扩散系数降低、光谱特性变化 * 4.变性沉淀分离的方法 1.热变性沉淀分离法 利用各种蛋白质对热的稳定性不同的特点，使蛋白质组分之间得以分离，同时使蛋白质与水及其他可溶性物质分离开来。 e.g.脂肪酶和淀粉酶热敏感性不同 40℃下处理2.5h（pH=3.4），可去除黑曲霉发酵液中90%以上的淀粉酶，从而制取较纯的脂肪酶。 * 腐竹制作工艺流程 利用大豆蛋白分子的热变性原理。 50-60℃ 变性 70-80℃ 分子结构有较大变化 * 2.选择性的酸碱变性沉淀分离 利用酸碱变性原理，调节溶液pH值，可有选择地去除杂蛋白，有利于提高酶制剂的比活和纯度。 E.g. 使用2.5%的三氯乙酸处理胰蛋白酶、抑肽酶活细胞色素c等粗酶提取液，可除去大量的杂蛋白。 大豆蛋白质pH低于2.2或高于12，出现变性现象，特点是粘性增加，溶解度下降。 * 3.利用酶作用进行变性分离 * 4.表面活性剂或有机溶剂引起变性 核酸制备：加入水酚、氯仿、十二烷基磺酸钠SDS等试剂，可选择性地使蛋白质变性，达到除杂、提纯核酸的目的。 * 二、生成盐类复合物沉淀分离法 1.金属盐复合物沉淀法 与羧酸、胺及杂环等含氮化合物作用的离子：Mn2＋、Fe2＋、Co2＋、Cu2＋、Zn2＋等。 与羧酸起作用的离子：Ca2＋、Ba2＋、Mg2＋、Pb2＋。 与巯基亲和的离子：Hg2＋、Ag＋、Pb2＋ * 2.有机盐沉淀法：苦味酸、苦酮酸、单宁、茶多酚等 茶多酚的优点：用量少（3％）；无苦涩味；不改变糖酸比；具有抗氧化能力。 3.无机盐法：磷钨酸和磷钼酸 * 三、非离子型聚合物沉淀分离法 非离子型聚合物：聚乙二醇（PEG）、壬苯乙烯化氧、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠 PEG：浓度为20%时粘度仍然不大，对蛋白质具保护作用，分离的选择性比硫酸铵好，操作简单，可处理量大。 * 沉淀原理 1.聚合物与大分子共沉淀而形成沉淀 2.聚合物与大分子以氢键结合形成复合物沉淀 3.聚合物与大分子争夺水分子，水分子在二者间重新分配，生物大分子产生脱水而沉淀。 4.聚合物对生物大分子的空间排斥作用。 * 非离子型聚合物沉淀分离法优点 1.操作条件温和，不会引起生物大分子变性； 2.具有较高的沉淀分离效果，成本低； 3.沉淀分离的选择性好，不同浓度可沉淀不同组分； 4.沉淀后的多聚物易于去除，可回收。 * 影响聚乙二醇沉淀生物大分子效果的因素 1.沉淀剂的相对分子质量越大效果越好，但受粘度影响（超过20000粘度太大不易操作）。一般2000-6000. 2.生物大分子的相对分子质量越大，沉淀效果越好； 3.生物大分子的浓度如太稀，效果不明显；太高则各组分之间互相作用系数越大，影响分离效果，10mmol/ml为宜 4.溶液中离子强度大时可使沉淀剂浓度明显降低； 5.生物大分子处于等电点时，使用的沉淀剂浓度也会明显降低。 * eg. PEG6000对相对分子质量95000的葡糖糖苷酶，半乳糖苷酶木糖苷酶等分离效果好，比活可提高20倍。 相对分子质量20000的木聚糖酶，即使PEG浓度达到25%，沉淀作用仍不理想 应用范围：PEG相对分子质量在2000-6000之间。 相对分子质量太小，起不到分离效果； 太大则粘度太大，不易操作。 * 作业 1.举例说明沉淀分离方法的分类。 2.硫酸铵用于蛋白质盐析的优缺点有哪些？ 3.有机沉淀剂沉淀分离法的基本原理是什么？ 4.举例说明变性沉淀分离方法的分类。 * * 在含难溶盐的溶液中，加入能与被测定的离子生成络合物的络合剂时，沉淀的溶解度随络合剂添加量的增大而增大。 二、　无机沉淀剂分离法 4.盐析后的脱盐： 方法： 1）透析 2）电渗析 3）葡聚糖凝胶过滤法 5.硫酸铵使用前的处理及饱和度的调整方法 1）使用前的处理：对含巯基蛋白质或酶，在使用硫酸铵前应除去其中重金属离子，以避免蛋白质或酶活性的丧失。方法：硫酸铵浓溶液－－通入H2S至饱和－－过夜后过滤除去重金属沉淀－－滤液蒸发结晶－－晶体100℃干燥。 2）硫酸铵饱和度的调整： 加固体盐（要求饱和度高）：加入量可参阅相关手册。 加饱和硫酸铵溶液（要求饱和度不高） 盐析时要求的饱和度及所需加入饱和硫酸铵溶液体积计算： V=V0(S2-S1)/(1-S2) V:需加入饱和硫酸铵溶液的体积 V0：待盐析溶液的体积 S1：原来溶液的硫酸铵饱和度 S2:需达到的硫酸铵饱和度 * 无机沉淀剂沉淀分离法缺点 分离的选择性较差 分离的灵敏性较差 * 第三节 有机沉淀剂