第二节高效液相色谱技术.ppt

第二节高效液相色谱技术简介 高效液相色谱 需要高压输送的流动相，又称高压液相色谱。 **高效液相色谱：以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 色谱仪示意图 1、HPLC的分离机理与分类 HPLC的分离依据是样品中各组分之间带电性，极性，疏水性，分子大小，等电点，亲和性，螯合性等理化性质的差异。 将样品导入柱头，流动相在高压泵的作用下，其流量被准确地控制通过色谱柱，样品中各组分在色谱柱中形成查速迁移，按时间先后流出层析柱，然后进行检测和分部收集。 按固定相对样品的保留机理，HPLC大致可分为液固色谱，键合相色谱，离子交换色谱，离子对色谱，凝胶色谱，疏水色谱，亲和色谱，聚焦色谱，金属螯合亲和色谱等。 HPLC柱子分类 分析柱 半制备柱 制备色谱柱 HPLC特点 高压、高速、高效、灵敏度高。 **HPLC与经典色谱相比的优点 教材：P74 二.高效液相色谱技术 2.1色谱柱的保养 2.2色谱柱的再生 2.3实验前准备工作 2.4 样品处理技术 2. HPLC的介绍及应用 一、HPLC的分离方式 1、液-固吸附色谱 2、液-液分配色谱 3、离子对色谱 4、离子交换色谱 5、分子排阻色谱 1、吸附色谱 液-固吸附色谱 液-液吸附色谱 根据填充剂吸附活性点对样品的吸收系数不同而分离 充填剂：硅胶 2、分配色谱 根据固定相与流动相的极性不同而分为 正相分配色谱和反相分配色谱 两者的区别如下图所示： 分配色谱 充填剂：多孔聚合物 ３、离子交换色谱 是根据固定相的离子交换基和样品成分中的离子性基进行交换来分离的 4、凝胶色谱 凝胶色谱分离方法是利用分子振动效应，根据样品分子的大小而进行分离。所以又称为排斥色谱 充填剂多采用：一定孔径的多孔性聚合物 二、LC在环保方面的应用 1、农药残留量分析 ：含氯农药 、有机磷农药 、除虫菊 2、致癌物质 ：霉素 、亚硝胺(香烟中的亚硝胺) 、苯并芘 3、水质分析 三、LC在生化方面的应用 1、蛋白质分析 2、肽类的分析 3、核酸 4、氨基酸 四、LC在药物方面的应用 1、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等 2、体液：血、尿、脊椎液、唾液等 3、抗菌素 ：青霉素 、甾族(激素) HPLC定性和定量分析 一、定性分析 （1）利用已知物对照法定性：保留特性、不同柱比较 教材P84 （2）色谱法与其它方法结合定性 二、 HPLC定量分析实用方法 1.外标法 教材p87 2.内标法 教材p87 分离纯化方案的设计 常规方法： １．先利用溶解度的差异进行粗提（高容量／低分离度）； ２．用色谱法进行纯化（低容量／高分离度）． 制备型HPLC 制备色谱不是分析色谱的简单放大，放大过程中通常要考虑色谱柱尺寸、填料、流量、操作压力、进样量、产品纯度、回收率以及色谱分离效果等因素。 在制备液相的线性放大过程中，使用小颗粒填料，可以获得较高的柱效(尤其是对于难分离物系，可以获得较高的分离度)，但压力太大，填料价昂；也可使用大颗粒填料，获得较大的生产能力，且填料便宜，但必须以牺牲柱效为代价，或者增加柱长以获得与小颗粒填料相同的柱效。 在高效制备液相色谱的线性放大过程中，柱尺寸(包括柱径和柱长)同填料粒径、柱效、操作方式等一起优化时，增加柱长，可以明显地提高效率，但在满足分离要求的前提下，宜采用较短的制备柱；增加柱径，虽然分离效果会有一定程度的损失，但可以显著提高制备量。 分析型HPLC和制备型HPLC 由于目的不同，分析型HPLC和制备型HPLC所选用的操作条件有显著不同。前者要求进样量愈小愈好，且避免柱超载；而后哲为了提高柱产量，一般需采用柱超载方式进行操作。 １、色谱方法的组合 方法的选择要互补，最重要。 每一个步骤获取的部分应尽可能适合于下个步骤对样品的要求，有利于减少步骤。 步骤间的缓冲液的变换也要满足下个步骤对样品和离子组成的要求。 ２、色谱分离条件的最佳化 需要合适的溶剂强度，即合适的容量因子k’ ，足够的柱效N和良好的分离选择性? 。 分离要求 一般要求要进行制备的样品中含主成分应在40-50%以上才能基本达到一次制备，否则必须进行多次实验才能满足制备的纯度高和量大要求 。 把难分离的收集下来再循环分离，通过对峰进行分割然后收集。 习题 electrophoresis —— YOUR LOGO HERE Copyright Biotechnology College