流感病毒的鉴定-福建疾病预防控制中心.PPT

流感病毒的鉴定 福建省卫生防疫站 杨式芹 一、原理 流感病毒粒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构。流感病毒的受体为含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，许多哺乳类动物和禽的红细胞表面均有此两种成分，因此，它们均能被流感病毒所识别和结合，并发生红细胞凝集现象。 于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制试验。 二、红细胞凝集试验及其抑制试验 红细胞凝集及其抑制试验按其容量多寡分为两大类： 1）常量法：总容量为0.75ml 2）微量法：总容量为常量法的1/10 国内把红细胞凝集抑制（HI）测定分为三种： 1）常规法 2）半加敏法 3）加敏法 鉴定结果判断： （1）标准参照血清对分离的抑制效价达≥ 20才可算为阳性。 （2）一个分离物不能被两种或以上标准参照血清同时有≥ 20的抑制。 （3）一个分离物被H3N2免疫血清有≥ 20抑制，而H1N1和乙型免疫血清抑制效价均20。可认为分离物H3亚型病毒，同理仅被H1N1免疫血清有≥ 20或仅被乙型免疫血清有≥ 20抑制，可认为分离物为H1亚型病毒或乙型病毒。 （4）三种标准参照血清对分离的抑制物效价均20，速将分离物送国家流感中心进一步鉴定。 交叉血凝抑制测定和抗原比计算 由于流感病毒的抗原性能经常不断地发生变异，变异程度与疾病发生与流行强度常成正相关。 交叉血凝抑制测定和抗原比计算仍为最简便、可靠和敏捷地了解流感病毒抗原性是否已发生变异，其变异幅度有多大的一种手段。 三、流感实验室检测中应注意的若干问题 1. 禁止在同一实验室和同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本和已知阳性标本。 2.禁止在同一实验室，同一时间处理接种采至不同动物的标本。动物的标本必须与人的标本分别保存。 3.接种后剩余原始标本,有条件的应置-70 ℃或以下保存，待分离物经国家流感中心鉴定完后方可处理掉。 谢 谢 大 家 ！ * * 流感病毒虽然能凝集多种哺乳类和禽类的红细胞，但应用最广泛的为 豚鼠、鸡和人“O”型的红细胞。 1.材料： 标准参照血清即国家流感中心必威体育精装版公布的甲3（H3N2），甲1（H1N1）和乙型 病毒的免疫血清。 标准参照抗原即国家流感中心必威体育精装版公布的H3N2，H1N1和乙型的病毒抗原。 质量可靠的受体破坏酶（RDE）。 配制好的1%鸡或豚鼠或人的红细胞。 0.85% NaCl。 干净的大孔塑料板。 10 ml和1 ml吸管或稀释器。 试管、三角瓶、试管架，笔。 消毒缸、冰盘、37℃和56℃水浴箱。 待鉴定病毒。 2.操作步骤 1）RDE处理标准参照血清 2）四个单位抗原的配制 3）红细胞凝集滴度计算（见表1） 4) 四个血凝单位复核测定 5）红细胞凝集抑制测定（见表2） 6）观察结果： 一层红细胞均匀地铺于孔壁上者为++++。 基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++。 红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++。 红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。 如用鸡红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的眼泪样为-。 如用豚鼠或人红细胞形成一个小圆圈，边缘光滑无任何小凝集者为-。 “±”即为可疑，计算时以“-”（阴性）处理。 计算时请参考以下口诀： ① 先整后算。表1中，1-4，6和7不必进行整理，而5中，必须将1:640处一个加号挪到1:320处，使1:320处为4个加号，而1:640处变成两个加号，然后再进行计算。 ② 两个加号不用算。如表1中3，其滴度为640。 ③ 小，小本身的1/8。如表1中2，1:640处仅一个加号，故其血凝滴度一定少于640，计算之：640-640/8=560。 ④ 大，大本身的1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，计算之：640+640/4=800。 ⑤ 两个极端取中间（均数）。如表1中1，1:320时4个加号，而1:640时阴性，计算之：320+640/2=480。 表中6结果表明，血凝滴度未抓住，它必然大于1280，也可能成≥1920。因1:1280的高一个稀释度为1:2560，1:2560时可能出现的结果应从“–”至“++++”，当“–”时，滴度为1920，其余情况下均大于1920。当然要想知道精确的滴度应重新滴定，直至终点抓住为止。7中是否有血凝滴度？不清楚，其血凝滴度肯定10，同理1:5处可能出现–～++++。当出现++++时，血凝滴度应为7.5，其余情况下均小于7.5。 四个血凝单位计算：将血凝单位除以4，表1中1它的四个血凝单位应为：480/4=120