两种曲霉的糖化性质比较.doc

两种曲酶糖化性质的比较研究 在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。 米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 1 材料与方法 1．1材料 菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4 1．2培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液体深层发酵液） 1．3试剂 1．33%可溶性淀粉；碘液；0.01MNacl-HAC缓冲液；6NHCL；DNS试剂；葡萄糖标准溶液 1．4实验仪器 电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司，DK-8D）；721型分光光度计（上海欣茂仪器有限公司，2C409035）；立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂，LDZX-75KB)；恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司，DHP060)；气浴恒温摇床（太仓市实验设备厂，TCYQ）。 1．5方法 1．5．1菌种培养 斜面菌种培养：将米曲霉和黑曲霉分别接种于土豆汁培养基和察式培养基上，于30~32℃下培养4~7天，待产生孢子后置于5℃中备用。 军种扩大培养：从斜面培养基中挑取一环孢子接种于麸皮培养基上，于30~32℃下培养，待长满孢子后备用。 1．5．2液化酶和糖化酶的发酵生产 孢子悬浮液的制备：挑取经扩培的菌种孢子，接入内含10ml无菌水的试管中，制成孢子悬浮液，并在此基础上，继续稀释成108个/ml孢子悬液。稀释时可利用血球计数板推断选择适宜稀释度的孢子悬液。 液化酶和糖化酶的发酵:取5%孢子悬浮液接种于液体深层发酵液中，置于30~32℃，200r/min旋转式摇床上控温发酵，并定期测定酶活力，和PH。 1．5．3酶活测定 粗酶液制备；定期取20ml发酵液经纱布过滤，1000g冷冻离心5min，取上清作为粗酶液。 液化酶活性测定；取1.5ml 1.33%可溶性淀粉于60C水浴5Min，加0.5ml酶液（或双蒸水作为空白对照），60℃反应10min，取O.1ml反应液加入10ml碘液，摇匀后680nm处测OD。每个样品作两个重复。 糖化酶（葡萄糖淀粉酶）活性测定；0.1ml1.33%可溶性淀粉加0.1ml酶液（或双蒸水作为空白对照）60℃水浴反应20min，立即加入1mlDNS试剂，沸水浴5MIN后冷却，加入4.8ml水，在520nm处测定OD值。 1．5．4发酵液中还原糖含量的测定 葡萄糖标准曲线的制作 取9支25*25试管，分别按下表加入试剂； 项目 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准溶液（ML） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水（ML） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS试剂（ML） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5