2005版药典药品微生物限度检查法课件.ppt

2005版药典药品微生物限度检查法 ;概念 ;环境条件 ;培养 温度;检验量 ;供试液的制备 ;;非水溶性供试品;一 、目的：确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性 二 、内容：细菌、霉菌及酵母菌数测定（即：对5株阳性对照实验菌株的回收率逐一进行验证） 三 、菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]、 大肠杆菌（Escherichia coli）[CMCC(F) 44102]、 白色念珠菌(Candida a lbicans )[CMCC(F ) 98001]、 黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003] 四 、方法：中国药典2005版微生物限度检查法方法验证实验 五 、方法验证：细菌、霉菌酵母菌数测定，至少应进行3次独立的平行实验，每次平行实验回收率逐均应在70%以上;微生物检查方法; 回收率测定 1) 试验组：分别1：10供试液1 ml、50~100cfu/ ml 试 验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌 2) 活菌组：测定每一菌株加的试验菌数 3) 供试液对照：测定供试品本底菌数 4) 稀释剂对照组;稀释剂对照组;1．取经37℃培养18-24小时，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌肉汤培养物1ml加9ml生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-9，为50~100个/ml，做活菌计数备用 2．取经25℃ 培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml加9 ml生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-7，为50~100个/ml，做活菌计数备用 3．取经25℃ 培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 取1 ml 加9 ml生理盐水，逐管10倍稀释为10-4 ~10-6约50~100个/ ml，做活菌计数备用 ;常规法;回收率计算;表1 菌落计数（cfu/ml）;培养基稀释法;离心法;薄膜过滤法;;薄膜过滤法注意事项： 1.滤膜孔径应不大于0.45um,直径约为50nm.选择滤膜材质时应保证供试品及溶剂不影响微生物的充分被截留.滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌. 2.使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液润湿滤膜.油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥.为发挥滤膜的最大过滤效率,应保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面. 3.供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗冲洗量为100ml,每片滤膜的总过滤量不宜过大,以避免滤膜上的微生物受损. ;4.阴性对照 取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照.阴性对照不得有菌生长. 5.培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌数应不超过100. 6.菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数.若滤膜上无菌落生长,以＜1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1ml供试品),或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数. ;中和法;控制菌检查;菌种 对试验菌种的要求同细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证。 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 生孢梭菌 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。 ;验证方法 （1）试验组 取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。 如常规法取10ml供试液加1ml菌液加入增菌培养基。 当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。;;;;检查法 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。 阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10~100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 ;举例;一.六味地黄丸微生物限度检查法;;二、非水溶性供试品（含凡士林基质及乳膏剂）供试液制备;三.双黄连口服液微生物限度检查法 ;;四. 培养基稀释法微生物限度检查;;革兰染色、镜检; 染色结果;革兰染色注意事项;革兰染色意义;一、大肠埃希菌