微生物实验理论与思考.doc

实验一 显微镜的使用及微生物大小测定的方法 　　二、基本原理 　　　现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，它们由机械装置和光学系统两大部分组成。物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。其中油镜的放大倍数最大，对微生物学最为重要。 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。其中镜台测微尺并不直接用来测量细胞大小 ，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。目镜测微尺每小格所代表的实际长度因显微镜的不同放大倍数而异，因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微格数，即可计算出细胞的实际大小. 两重合线间镜台测微尺格数×10 目镜测微尺每格长度= 两重合线间目镜测微尺格数 　思考题 1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ 答（1）应先用摖镜纸将镜头摖干净，以防止实验的污染。使用油镜时，应先用低倍镜再用高倍镜，然后再是油镜，用完之后也要用摖镜纸将油镜摖掉。 （2）滴加香柏油 （3）作用是增加折射率，即增加了显微镜的分辨率，油的折射率和分辨率成反比，同时与波长成正比。 2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：显微镜的分辨率指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力，最小分辨距离越小，分辨率越高，最小可分辨率距离=λ／2NA且NA=n.sin,所以，分辨率由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定，当然还有介质的折射率。 3、为什么要换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？ 答：不同放大倍数，目镜测微尺每小隔所代表实际长度不一样，必须用镜台测微尺进行重新校正，这样目镜测微尺测量的长度才是目前状态的准备长度。 4、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一微生物的大小时，其测定的结果是否相同？为什么？ 答：相同的，不同的放大倍数，目镜测微尺每小格所代表实际长度不一样，必须重新校正，才能得到目前状态的准确长度。 实验二　显微镜直接计数法 二、基本原理 　　　显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），其优点是直观、快速、操作简单。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器及Hawksley计菌器等。利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。此法是将单细胞微生物的悬液或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中。在显微镜下进行计数的，由于加盖盖玻片之后的血球计数板的计数室的容积是一定的（0.1mm3，万分之一毫升），所以可根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内的微生物总数目，包括死菌和活菌。 　　六、思考题 　　根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？ 答：①操作时没有先盖盖玻片再加悬液导致体积不准确。避免：先盖盖玻片再滴加悬液 ②细胞：多稀释溶液 ③溶液不均匀 避免：滴加溶液前混匀悬液 实验三 二、基本原理 微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；玻璃器皿的洗涤方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。清洗后的玻璃器皿、经包装后即可进行干热灭菌。 干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种（P59）。火焰烧灼灭菌适用于载玻片、试管口、玻棒、接种工具和金属用具如镊子等的灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内利用高温干燥空气使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。而细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固变越快，反之反之。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160－170℃），时间长（1-2h）.但干热灭菌温度不能超过180℃ 思考题 为什么在吸管的包装时要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？ 答：以免使用时将杀菌吹入其中或不甚将微生物吸出管外。 在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？ 答：①物品不要摆的太拥挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要直接触电热干燥箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。 ②干热灭菌的过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。电热干燥箱具有可以观察的窗口，灭菌的过程中玻璃温度较高，注