The PCR cycle课件.ppt

PCR 及分子标记; PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. Peoples Choice Reaction ;The PCR cycle; 历史 60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝 尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复过程便可克隆tRNA基因”。 核酸体外扩增最早设想遗忘: 当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物； 当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能 ;Kary Mullis(1985) 发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 发展过程： 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。;专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。 美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器 ;PCR发展速度 惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获 ;原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 ;procedures;Primer design Most imp. (1)length: 20～30bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no complementary sequence (4)3‘end of the primer: no modification (5)5‘end of the primer:product length，can be modified (6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base;Primer designed with the help of computer DNA database conservative region comparision primers or blast ;PCR reaction components and their functions template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable ;primes If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5’-ends of the primers. Can amplify fragments