第8章血清型.ppt

第八章 血清型; 第一节 概 述;二、血清型的分类与命名 根据分型原理不同，血清型可以分为两大 类： 1、同种异型遗传标记 是指同一种属不同个体免疫球蛋白抗 原性的差别，可采用特异性抗血清分 型。如免疫球蛋白Gm、Km等;这类血清型的命名多以抗原所在的肽链名 称加抗原编号组成。 如Glm抗原表示该抗原位于免疫球蛋白 IgG1γ重链上;2、血清蛋白的电泳多态性遗传标记 是指不同个体血清蛋白的电泳特性的差 异。是血清蛋白多肽链中部分肽链或个 别氨基酸不同，引起电泳迁移率发生变 化构成的多态性;这类血清型的命名通常是蛋白的缩写 名称加表示等位基因的数字或字母， 如Hp1－1;三、分型原理 1、免疫学的方法可以用来进行同种异型 遗传标记的分型，以特异性的抗体检 测同种异型抗原，确定遗传标记的型 别。如红细胞被动凝集抑制试验、酶联 免疫分析等;2、在法医学鉴定中应用的血清型多数属于电泳性质上的多态性，需要采用凝胶电泳技术分型 其分型原理为：不同表型的蛋白质一级结 构存在差异，分子量和等电点不同，在电 场中的迁移率不同，可依据蛋白谱带位置 进行分型;等电聚焦技术则依靠不同蛋白分子之间等 电点差异进行分型，分辨率比常规凝胶电 泳高，能够揭示许多普通电泳难以检出的 多态性。如维生素D结合蛋白普通电泳分 为三种表现型，而等电聚焦技术分为六种;等电聚焦电泳原理： 所有的氨基酸均为两性物质，在酸性溶液中带正 电荷，在碱性溶液中带负电荷。 若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场 中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电 点）。 当溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白质分子 所带净电荷为同号，彼此之间有相斥力，不会聚 集。 所以，將pH调到等电点的大小，则大部份 的蛋白质將会沉淀，可以应用在电泳，达到分离 蛋白质混合物的目的，这种方法称为等电聚焦电 泳;;3、有些血清型在分型之前，样品需经神经氨酸酶或其他试剂处理，如转铁蛋白分型。 因为糖蛋白糖侧链的电荷会影响蛋白电泳迁移率;4、电泳后的血清型谱带的显示可以用普通蛋白染色、免疫固定或免疫印迹法 蛋白染色操作简便，但谱带无特异性 免疫固定后染色为特异性显色方法，主要 是利用抗原抗体的特异性反应识别特异性 蛋白;典型的印迹实验包括三个步骤：????①蛋白质的电泳分离????②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域????③免疫学检测。 免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直 接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大 地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其 成为使用最广泛的免疫化学方法之一。 ;;第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS）。抗原等蛋白样品经 SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝 胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小， 泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼 不可见（只有在染色后才显出电泳区 带）。;第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离 的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电 压（100V）和大电流（1～2A），通电 45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白 质条带肉眼仍不可见。;第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条 带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的 固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二 抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的 酶反应底物，使区带染色。 ;?几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫 印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化 学技术进行研究的蛋白质样品。例如，不 能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液 的蛋白质等 ;6、DNA分型技术也可用于血清型分型。个体差异的实质是人类基因组编码DNA的差异;四、法医学意义 自1939年发现血清中Hp的遗传多态性以来，血清型因分型可靠，个体识别率高等原因受到法医学的重视，多种血清型成为亲子鉴定选择的遗传标记; 第二节 结合珠蛋白型;一、Hp的生化性质与生物学功能 由肝脏合成，等电点为4.1－4.2，电泳 属于α2－球蛋白组分。含糖量为18.6％ 其主要功能是与游离血红蛋白结合成稳定的复合物，并很快被单核-巨噬细胞系统处理掉，阻止了血红蛋白从肾小球滤过，避免游离血红蛋白对肾小管的损害 ;结合珠蛋白是一种血浆糖蛋白，分子量约 为90.000。能与红细胞外血红蛋白(Hb)结 合形成紧密的非共价复合物Hb-Hp。每天降 解的Hb约有10%释入血循环中，成为红细胞 外游离的Hb，Hb与Hp结合成Hb-Hp复合物 后分子量可达155,000，不能透过肾小球，从