19-核酸研究技术.ppt

* 19.1 DNA核苷酸序列的确定 19.2 重组 DNA 技术 19.3 PCR技术 19.4 转基因技术 19.5 基因治疗技术 19 核酸研究技术 常用的是Sanger的双脱氧链终止法。该技术的发展是与DNA电泳技术的发展分不开的。因为DNA电泳可以将大小只差一个核苷酸的DNA片段分开。DNA电泳类似于蛋白质电泳，分析短的DNA片段常使用聚丙烯酰胺作为凝胶的基质，分析长的DNA片段时使用的基质主要是琼脂糖。 Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂，2ˊ,3ˊ-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3ˊ位又少了个羟基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。 19.1 DNA核苷酸序列的确定 双脱氧核苷三磷酸 互补链合成过程 如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。 在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。 Sanger双脱氧测序方法示意图 19.2 重组 DNA 技术 Paul Berg, Herbert Boyer和 Stanley Cohen 共同获得诺贝尔奖，主要贡献是发现限制性内切酶酶可以象一把“剪刀”那样裁剪DNA。DNA片段经DNA连接酶催化与外源DNA连接，连接酶象“ 分子胶带”将DNA片段共价重新连接起来。 由不同来源的DNA组成的DNA分子称为重组DNA分子，这样的操作方法就是现在常说的重组DNA技术，也叫做基因工程。 重组DNA技术作为一个工具是建立在以下三个关键步骤的基础上： 第一是需要限制性内切酶在特定的位点切割外源DNA。 第二是将分离出的DNA片段与作为载体的第二个DNA连接。用重组的质粒转化宿主菌，获得含有重组DNA的转化体。然后对转化体进行培养，对重组DNA进行扩增。 第三是有能力鉴别出含有重组DNA的质粒克隆，这可利用DNA杂化技术来实现。重组DNA的复制（克隆）可以制造出成千上万的感兴趣基因的拷贝，而且如果基因被表达，可以生产出亿万个产物的拷贝。 载体常常是来自大肠杆菌的质粒，质粒有在细菌细胞内自我复制的能力，而且修饰过的质粒含有氨卞青霉素抗性（Ampr）基因，插入的抗性基因为以后筛选用。 含有重组DNA分子的质粒导入宿主菌（常用的是经氯化钙处理的E,coli.）进行DNA放大，这一步骤称为克隆。因为从带有重组质粒DNA的单一菌种获得的所有质粒DNA都是一样的。 DNA连接酶 合成的含有多酶切位点聚合物 构建的质粒 构建质粒 外源DNA和质粒都是用同样的两个酶切的，然后构建成含有外源基因的质粒 靶DNA 质粒载体 插入外源DNA 平末端 粘性末端 转化大肠杆菌感受态细胞，培养转化细胞。 筛 选 平皿中的菌落 用绒布吸附菌落 转移到薄膜上 用碱处理 DNA结合在膜上 放射性探针与他的互补DNA杂化 探针检测到含有靶DNA的菌落 与放射性探针一起退火 在实验室一个重组DNA分子制作过程的基本步骤主要包括6个基本步骤，以下按图中序号给以简单说明。 酶切 制备DNA 连接 转化 复制、筛选 连接 制备外源DNA EcoRI酶切 EcoRI酶切 转化 细胞分裂、筛选 1、制备DNA。可以利用各种常规的方法从组织或细胞中分离DNA，或者是通过人工合成方法合成。 2、在特定位点切割DNA。用同一种酶限制性内切酶切割外源DNA和质粒载体。 3、连接DNA片段。利用连接酶将从外源DNA获得的靶DNA与经同一种酶切割的质粒载体连接，构建成一个含有靶DNA的重组DNA分子，也称之重组质粒。 4、将重组质粒导入合适的宿主细胞。为了使重组DNA分子增殖，必须将它导入合适的宿主菌，通过细菌的繁殖，才能获得重组质粒的克隆。外源DNA分子导入宿主细胞时，如果是直接导入称为转化；如果是利用一个病毒作为运载工具导入称为转染。 5、重组DNA在宿主细胞内大量复制。转化的效率一般都比较低，只有少量的宿主细胞吸纳了重组质粒。由于通常载体都含有抗生素抗性基因，例如插入到质粒中的氨卞青霉素抗性基因Ampr，经在含有氨卞青霉素培养基