Asn-Ala-之间的肽键。4.3蛋白质一级结构的测定第六步.ppt

主要内容 1、蛋白质通论 2、肽 3、蛋白质一级结构的测定 4、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 （一）蛋白质的化学组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50％ 氢 7％ 氧 23％ 氮 16% 硫 0—3％ 其他 微 量 蛋白质的含氮量 蛋白质中氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： 蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数 ? 6.25 蛋白质的分类 组成上分：单纯蛋白质、缀合蛋白质。 功能上分：酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白等9类。 形状上分：纤维蛋白、球蛋白、膜蛋白。 （二）蛋白质的大小 蛋白质是相对分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。 蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。一般规定最小的蛋白质是胰岛素，相对分子量为5.7K。 某些蛋白质是由两个或更多个多肽链通过非共价键结合而成的，称寡聚蛋白质。每条多肽链称为亚基或亚单位。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。 （三） 蛋白质结构层次 二、 肽PEPTIDE 三、蛋白质一级结构的测定 1969年，国际纯粹与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。 蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 氨基酸序列测定有直接法和间接法两种：直接法，用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出氨基酸顺序；间接法，通过测定蛋白质之基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断氨基酸的顺序。这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测序工作要更方便、更准确。 第一步、前期准备 分离纯化蛋白质 （ 纯度97%以上） 蛋白质分子量的测定 （电泳法、凝胶过滤法、超离心法等 ） 第二步、多肽链的数目测定与拆分 A、测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质摩尔数之间的关系，即可确定多肽链的数目。 B.多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 对于借助非共价键连接在一起的几条多肽链，如，四聚体血红蛋白，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 对于几条多肽链通过二硫键交联在一起的。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 也可应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键 第三步、蛋白质的氨基酸组成分析 首先用6M HCl将蛋白质样品水解 水解后样品用离子交换色谱分离，然后与茚三酮反应后，被检测器定量检测。 也可通过反相HPLC分离检测。方法是先将样品与Edman试剂（PITC）反应，然后利用氨基酸侧链疏水性的差异进行分离。 第四步、分析多肽链的N-末端和C-末端 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸和C-端氨基酸。 N-端氨基酸和C-端氨基酸分析的目的是建立两个重要的氨基酸序列参考点。 N-端氨基酸测定——DNFB法 测定路线：DNFB→DNP-肽→酸水解→乙醚萃取→层析鉴定 。 特点：α-DNP氨基酸容易和侧链DNP氨基酸分离。 N-端氨基酸测定——丹磺酰氯法 测定路线：DNS- DNS-肽→酸水解→乙醚萃取→层析鉴定 。 特点：DNS-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 N-端氨基酸测定——PITC法 测定路线：PITC→PTC-肽→PTH-氨基酸→乙醚萃取→层析鉴定 。 特点：只切去N端-氨基酸，其余肽端保持完整。 N-端氨基酸测定——氨肽酶法 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解肽键。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 常用的有亮氨酸氨肽酶（水解N-末端为Leu的肽键速度最快）、焦谷氨酸氨肽酶（水解N-末端为焦谷氨酸，即环化的谷氨酸）。 C