dld006-蛋白定量(BCA法)-最强实验protocol.doc

蛋白定量 Protein Quantitation 【蛋白定量的背景知识】 “蛋白定量”即蛋白质定量，蛋白质定量根据其目的分为全蛋白质的“总定量法”和特定蛋白质的“个别定量法”。 蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。 ① 为验证细胞裂解是否成功； ② 或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量； ③ 为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量； ④ 为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。 蛋白定量分析涉及到生产科研的多个领域及行业，也是生物学科、食品检验及打击掺假掺伪、临床检验、诊断疾病和质量检验中最常见的方法。 蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科常涉及的分析内容。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是一项经常进行的非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。 现测定蛋白质含量方法有很多 ① 根据物理性质：紫外分光光度法； ② 根据化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法、胶体金法； ③ 根据染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法； ④ 根据其他性质：荧光法； 蛋白定量的测试方法有很多种，其中较为常见的有五种，分别是Bradford法、Bradford斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法及BCA法这五种。当然，每种方法适用的情况都有所不同。 BCA蛋白定量和 Bradford法蛋白定量的区别 Bradford法测得的主要是碱性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA则没有选择性 （2）BCA法蛋白浓度定量是在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成（iuret Reaction），Cu+和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个Cu+，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。 Bradford法蛋白定量是染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收波峰的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4 ) 2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 estern Blot实验常用于检测蛋白表达量、蛋白表达产物的正确性等。相对于其他检测蛋白的方法而言Western Blot实验在蛋白的定性定量分析、与目的蛋白量的比较方面更简单一些。 （常见的内参基因有β-Actin，GAPDH等，具体需参考文献）内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在estern Blotting实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 虽然，顺利的时候estern Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果、假阳性、结果出现多条带、到底是一抗有问题还是二抗有问题毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不像1+1”那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性。所以，严谨的 Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果的分析非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。 良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)、空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。 实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Bl