《天然药物分析》6章HPLC.ppt

《 中药（天然药物）分析 》 第六章 高效液相色谱法的应用 高效液相色谱法具有应用范围广的优点，表现在： （1）HPLC不受试样挥发性和相对分子质量的限制，可用于分离高沸点、相对分子量大、热稳定性差的有机化合物，还可用于各种离子的分离； （2）HPLC不仅可利用被分离组分的极性差别，还可利用组分分子尺寸大小的差别、离子交换能力的差别以及生物分子间亲和力的差别进行分离。它还可以用多种溶剂作为流动相，对于性质和结构类似的物质，分离的可能性比气相色谱法更大； （3）HPLC易于收集流出物组分，可利用制备柱进行较大量的制备。 第一节 高效液相色谱的技术参数 一．速率理论 图6-1是气相色谱法和高效液相色谱法的H-μ曲线。由图可见，两者形状明显不同。HPLC法接近一条直线，而气相色谱法曲线中有一极小值。 在HPLC中，由于流动相是液相，影响柱效的因素与GC不完全相同。因此，范第姆特方程（H = A + B/ μ + C μ ）应作修正。 在范第姆特方程中，HPLC与GC的涡流扩散项完全相同。 HPLC的分子扩散项是因同种组分分子由浓度大的谱带中心向浓度较低的两边扩散所引起。它与组分分子的流动相中的扩散系数（Dm）成正比，与流动相的平均线速（μ）成反比。 HPLC的传质阻力是由组分在两相间的传质过程实际上不能瞬间达到平衡而引起的，其传质阻力相包括三项：固定相传质阻力（Hs），移动流动相传质阻力（Hm）和滞留流动相传质阻力（Hsm），即: 气相色谱法主要考虑固定相的传质阻力；液相色谱法与之不同，在整个传质过程中起主要作用的是流动相传质阻力，特别是滞留流动相的传质阻力，因此，改进固定相结构，减小滞留流动相传质阻力是提高液相色谱柱效的关键。 以上各项可归纳为： 要想提高液相色谱法的柱效，必须用小而均匀的固定相颗粒且要填充均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力。 改进固定相的结构，对于减小滞留流动相传质阻力以及固定相传质阻力至关重要。 此外，选用低黏度的流动相（如甲醇、乙腈等），也有利于减小传质阻力，提高柱效。 二．柱外效应 柱外效应（ extra column effect）是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，又称柱外展宽。它分为柱前和柱后两种。 1．柱前展宽 主要由进样引起。HPLC进样常采用两种方式：阀门进样，试样由流动相带入柱内，进样阀有死体积，会引起峰的展宽；注射进样，将试样注入液流中，或注入填料顶端，进样器内的死体积和进样时液体扰动而引起的扩散，均会引起峰的展宽。 减小进样阀的死体积，或者将试样直接注射到填料顶端中心点或中心点以内1~2mm处，可减少柱前的扩散，使柱效显著提高。 2．柱后展宽 是由接管和检测器流通池以及检测器响应时间等因素引起。流动相在接管中心流速较大，而管壁附近流速较慢，管中心处组分比管壁部分先到达检测器，引起峰的展宽。因此尽可能用短的接管，减少流通池体积，可以提高柱效。 检测器、放大器和记录仪响应较慢，也会使描绘的色谱峰宽增加，峰高降低，对于保留值较小的组分影响尤为突出。所以，改进检测器和记录系统的响应速度也是克服柱后展宽的一个途径。 三．分离度 色谱法的关键问题之一，就是难分离组分的分离问题。前已提出，有效塔板数（neff），是评价柱效应的一项指标，相对保留值（ris）是衡量色谱柱选择性的另一项指标。但这两项指标未能说明难分离组分的真实分离效果。 气相色谱的分离效果可直接表现在色谱的峰间距离和峰宽上，只有相邻两个色谱峰的距离较大、峰宽较窄时，两个组分才能得到良好的分离。 综合考虑保留值的差值与峰宽对柱效率的影响，常用分离度作为色谱柱的总分离效能指标，以判断难分离物质对在色谱柱中的分离情况。 分离度用R表示，其定义为：相邻两色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰宽平均值之比值，即： R越大，两色谱峰距离越远，分离效果越好。R 1时两峰有部分重叠；R =1，两峰有98%的分离；R =1.5时，分离程度可达99.7%。当R =1.5时，为相邻两峰完全分离标志。 为了找出影响分离度的主要因素，可由式（6-8），推导出总分离效能方程式，即： （6-9） 式中， ：柱效相； ：柱选择相； 容量因子相。 如何提高分离度 1. 通过下列方法增加保留时间 （1）选择合适的分离参数 （2）增加色谱柱长度 （3）增加固定相浓度 2. 通过下列