《现代食品微生物学》实验：土壤中的微生物分离纯化和菌相分析 上海海洋大学 硕士课程 宁喜斌 欧杰.ppt

土壤中的微生物分离纯化和菌相分析 一、实验目的 掌握用平板分离法和划线分离法分离土壤中的微生物（好气性细菌、放线菌和一般真菌）。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某 一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 分离微生物时一般是根据该微生物对营养、PH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。 微生物分离纯化的方法主要有：平板划线分离法 和稀释涂布平板法。后者除能有效分离纯化微生物 外，还可用于测定样品中活菌数量。 三、实验器材 1.土壤 2.培养基： 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂）（50μg/mL制霉菌素乙醇溶液） 高氏一号琼脂培养基（10滴100g/L石碳酸和50μg/mL制霉菌素乙醇溶液） 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（1000mL培养基中加入2mL氯霉素） 3.溶液与试剂： 9mL或4.5mL无菌水的试管，90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶 四、操作步骤 1.倒平板：将培养基加热溶化，保温55-60℃，每个培养皿倒入15-20mL培养基，静置冷却固化。 倒平板的方法： 右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边， 用左手将试管塞或瓶塞轻轻的拔出，试管口或瓶口保 持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹 住试管塞。左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一缝， 迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使 培养基均匀分布在底皿底部，然后平置于桌面上，待 凝后即为平板。 2.制备十倍梯度菌稀释液：用一支1mL无菌 吸管吸取0.5mL菌悬液加入4.5mL无菌水的 试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类 推制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6六种十倍 梯度稀释的菌悬液。 3.涂布：将上述每种培养基的平板底部或培养 皿盖周边用记号笔分别写上10-4、10-5和10-6三种 稀释度字样，每种培养基每稀释度标记2皿，然后 用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6 三管菌悬液中吸 取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置， 每皿准确放入0.2mL，用无菌玻璃涂布棒在培养基表 面轻轻涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻 的来回推动，使之分布均匀，然后改变方向90°沿另 一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂布 棒在涂布几次，室温下静置5-10min。 4.培养：将平板倒置于37℃温室中培 养1-2d。 5.挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许 菌苔接种在不同培养基的斜面上，置37℃/28 ℃培养；待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞图片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物细胞。若发现有杂菌，须再进行一次分离与纯化直到获得纯培养。 1.倒平板 2.划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取待测菌悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，培养后能形成单个菌落。 划线方法 方法一：用接种环按无菌操作挑取土壤悬液一环， 先在平板培养基的一边作第一次平行线3-4次，再 转动平板约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷 却后挑取悬液穿过第一次划线部分进行第二次划线， 再用同样的方法穿过第二次划线部分进行第三次划线 或再穿过第三次划线部分进行第四次划线。划线完毕 后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。 方法二：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连 续划线，完毕后，盖上培养皿盖，温室培 养。 3.挑菌落：从分离的平板上单个菌落挑取 少许菌苔于不同培养基斜面上，做锯齿状划 线，37℃培养后，涂在载玻片上，在显微镜 下观 察细胞的个体形态，结合菌落形态特 征，综合分析。如不纯，仍需平板分离法进 行纯化，直至确认为纯化培养为止。 一、实验原理 平板菌落计数法（活菌计数）是根据微生物在固 体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖 而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个 单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再 取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分 布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生 长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品 中的含菌数。 这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。 但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各 种因素的影响。 二、实验步骤（方法一） 1.编号：取无菌培养皿6套，分别用记号笔表明 10-4、10-5、10-6各2套。另取6支4.5mL无菌水 的试管，依次表明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6