3第二章 基因操作的主要技术原理-3.ppt

第五节 基因的化学合成 化学合成法优缺点 优点：准确性极高，合成速度较快 缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80个碱基) 一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、较小基因的合成。 对于超过该法合成范围的寡核苷酸链的合成，可采用分段合成法。 生物化学法 即在体外以目的DNA片段为模扳，利用酶学反应(Klenow酶或Taq酶)，在特异引物的引导下，合成特异的DNA片段。 目前最常用的方法是PCR法。 生物化学法优缺点 优点：合成基因效率高、速度快、特异性好。随着PCR技术的发展，现在已能合成长达几十kb的DNA片段。 缺点：产物中可能有1／l0000-l／1000的错配率，也就是说，PCR产物中可能存在突变体，因此，通过PCR克隆的基因，必须通过DNA序列测定才能确认。 目的基因的获取 1. 化学合成法 　　已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 　 　 基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。 位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。 PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。 一、传统的诱变 利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体 射线（紫外线、X射线、γ射线等） 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等） 不足： 经诱变剂处理的生物体，它的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难 即使分离到期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核苷酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质（单碱基或DNA片段） 定点诱变（site-directed mutagenesis) 体外特异性改变某个碱基的技术，能够取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基 研究基因的结构与功能的关系 获得所需功能的突变体蛋白质 基因工程技术可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement) 。 盒式突变的具体操作是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。 盒式突变的两个关键问题： 目标基因中要有适当的限制性内切酶识别位点。对于天然蛋白质来说，其所含可供利用的限制性内切酶识别位点很少，可利用遗传密码的简并性在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限制性内切酶位点，便于盒式突变的操作。 用于取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段的获得。目前利用PCR技术可产生具有特定限制性内切酶位点的、具有各种突变位点的盒式突变DNA片段的技术已经很成熟。 这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，也称为专一性位点突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 ①诱变原理： 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于DNA模板的制备 寡核苷酸突变引物的设计和选择 寡核苷酸突变引物与DNA模板的退火和引物延伸条件 DNA聚合酶的选择 存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响 受体细胞对突变体产率的影响 关于DNA模板的制备 双链DNA模板：质粒 单链DNA模板：M13噬菌体载体，足够纯净(避免RNA污染) 寡核苷酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件 退火条件： 突变引物与模板DNA的浓度比为10－50；退火通常将二者混合物加热到Tm值以上20度，然后再缓慢冷却到室温；对于A＋T含量高的引物，为