PH0642 T4连接酶 T4 DNA Ligase 实验操作手册与方法.pdf

PH0642 | T4 DNA Ligase （T4 连接酶） atalog No：PH0642 Size： 100U Store at -20℃  简介 T4 DNA Ligase 是从表达T4 DNA Ligase 基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化而来的，催化相邻DNA 链的5’磷酸基团和3’ 羟基基团以磷酸二酯键结合反应。该酶可催化平末端或粘性末端DNA 之间的连接，还可修复双链DNA、RNA、DNA/RNA 杂交 双链中的单链切口。本品可应用于DNA 插入片段和载体DNA 的粘性末端和平末端的连接，以及线性DNA 的自身环化。 活性定义：此酶的活力单位为Weiss Unit。1 个Weiss Unit 相当于约200 个粘性末端连接单位 （cohesive-end ligationunit, EU）。 1 个 EU 单位定义为在20 μl 的连接反应体系中，在16℃30 分钟内，能使50%的经HindIII 消化的λDNA 片段连接所需的酶 量。  存储 -20℃保存  组分 名称 规格 T4 DNA ligase (5U/ μl) 100 U (20 μl) 10×T4 DNA Ligation Buffer 0.15 ML 50%PEG Solution 0.15 ML  使用方法 一 DNA 片段和载体DNA 的连接 1）粘性末端的连接 1．反应体系: 10 μl 体系 终浓度 线性载体DNA x μl 10-50 ng 插入DNA 片段 y μl 插入片段：载体=1:1-5:1* 10×ligation buffer 1 μl 1× T4 DNA ligase(5U/ μl) 0.1 μl 0.5 U ddH2O up to 10 μl *：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert 在1:1~1:5 之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔 数：pmol 数= DNA 量(ng)/(660×片段bp 数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng （0.025pmol），10 μl 连接体系中vector:insert 的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol 数为0.075pmol，插入片段2000bp 的使 用量为100ng。 2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。 3．反应条件：16℃孵育30 分钟。 4 5 l 50 l 1-2 l 50 l ．可取 μ 连接产物热击转化 μ 感受态细胞或取 μ 连接产物电击转化 μ 感受态细胞。 注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10 分钟或70℃孵育5 分钟以灭活T4 DNA Ligase 后，用DNA 产物纯化试剂盒 对连接后的DNA 片段进行纯化后进行电击转化。 2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1 小时。 3 10 l T4 1U DNA ）在 μ 连接体系中若 连接酶的终浓度大于 ，必须对连接后的 片段进行纯化后方可进行电转。 2）平末端的连接 1．反应体系: 10 μl 体系 终浓度 线性平末端载体DNA