制备型等电聚焦电泳.ppt

制备型等电聚焦电泳原理 离子交换膜 离子交换膜位于电极和聚焦槽间，允许电流自由通过同时将样品和电解质隔离。该膜能够在聚焦槽两侧形成离子梯度，利于pH梯度形成。仪器使用两种不同的离子交换膜，二者不能交换使用。 离子交换膜在使用之前放置于电解液中平衡过夜。 离子交换膜以及平衡用的电解液 实验步骤 2、组装聚焦槽并密封取样出口。 包括如何放置电极膜以及电极槽和聚焦槽的组装 ①使用去离子水清洗电极膜（离子交换膜） ②分别将阳极膜和阴极膜嵌入聚焦槽两端 ③将电极槽与聚焦槽组装 ④调节聚焦槽的上样口使其与电极的通气孔成一直线 实验步骤 3、将样品加入到聚焦槽中并密封上样口。 加样： 聚焦槽有两排出口，其中一排与电极通风孔成一直线用于加样品，而与其相对的另外一排出口则用于样品收集。在加载样品前将取样口端密封。加载样品后，加载口端同样要求密封。 ①用密封带密封取样口时要保证密封带恰好把取样口密封，不要剩余很多否则在仪器振荡时，容易松动，产生泄漏现象。 ②用载样注射器吸取样品溶液，从位于聚焦槽中央的载样口上样，至样品溶液全部均匀渗漏到各个腔体内；或者采用在不同载样口上样，至样品溶液在聚焦槽各个腔体分布均匀。（注意:在上样过程中注意不要产生气泡，否则样品溶液在各个腔体内分布不均匀。如果出现气泡，可以将样品吸出，从另外的载样口上样，注意同样不能产生气泡。 ③加载样品后，核实每一个聚焦体腔内是否充满样品溶液，并保证无气泡。如果存在气泡，将影响后续的分离，因此请按上步措施进行处理。 ④擦干聚焦槽外部，用密封带将上样口密封。不要使用过长或过宽的密封带，否则在仪器振荡时，容易松动，产生泄漏现象。 实验步骤 4、在电极槽中加入电解液。 实验步骤 5、聚焦 ①首先将制冷装置上的旋钮旋开。 ②将聚焦装置放入仪器底盘，聚焦槽上样口端和电极通气口端向上。核实阳极端在左，阴极端在右。 ③用注射器向电极中加入电解液 ④加盖制冷装置盖子，并旋紧螺杆。 ⑤加盖仪器盖子 ⑥连接micro rotofor 分离器底盘后电源线和电源插座 ⑦连接micro rotofor 分离器到真空装置。 ⑧将振荡装置 ⑨根据实验需要将制冷开关设置到10或20 ℃ ⑩通过观察电压的变化过程，可以指示聚焦是否完成。 ⑩通过观察电压的变化过程，可以指示聚焦是否完成。如果电压稳定于某一值时，继续聚焦，然后收集组份。过长的聚焦时间不但不能提高聚焦效果，还会引起pH梯度的下降。 组份收集 为了防止样品扩散，聚焦结束后马上收集样品组份 ①切断振荡和制冷装置的电源，打开micro rotofor 分离器的顶盖 ② micro rotofor 分离器与真空装置相连，以及收集装置妥当 核实 ③打开制冷装置顶盖，用镊子将密封带取下 ④打开真空装置 ⑤将聚焦槽装置小心的从仪器电极连接处取下，该过程始终保持聚焦槽样品槽口端向上（其密封带已经取下） ⑥将聚焦装置放入收集装置顶端。调整聚焦槽使其成水平，使排针与取样 口平行，不要刺破取样口的密封带。 ⑧双手控制聚焦槽并向下方按下，使排针刺穿取样口的密封膜。过程中不能堵塞聚焦槽上样口。同时用双手的拇指将收集盘插入真空装置。 ⑧双手控制聚焦槽并向下方按下，使排针刺穿取样口的密封膜。过程中不能堵塞聚焦槽上样口。同时用双手的拇指将收集盘插入真空装置。继续按压聚焦槽数秒，是分离的样品组份吸入收集盘。 ⑨取下收集盘，关闭真空装置 ⑩用注射器或移液器将个组份样品转移到其他容器中 课后问题1 1、影响pH梯度的因素 由于样品制备问题、micro rotofor 分离器的不恰当使用都会产生非线性的pH梯度。具体因素如下： 电解液泄露：电解液通过离子交换膜渗漏到聚焦分离腔内将会引起pH梯度变化，降低样品间的有效电压。通常使用了有裂痕、脱水的货使用旧的离子交换膜。如果保存方法妥当，一张膜可以使用4-5次。 不平衡收集：收集体积的变化将明显影响组份的线性梯度。 过早收集：在聚焦未完成时收集各组份，将影响pH梯度的线性以及蛋白的聚焦。 样品中盐离子过高：一个高电压梯度以及在pH梯度范围内保持最多的分离数目，可以保证有很好的分辨率。但是如果样品中含有很高的盐离子，它将降低聚焦分离腔内的有效电压并降低线性pH梯度内组份的数目。可以使用两性电解质代替盐离子来增加离子强度，以利于保证蛋白质良好的溶解性。 样品中缓冲溶液浓度过高：蛋白样品中过量的缓冲成份会使pH梯度趋于水平。 pH梯度将在缓冲溶液的pKa产生缓冲，是各分离组份具有相同的pH值。 两性电解质的影响：两性电解质的质量影响到pH梯度的线性范围和重复性。每一批次以及不同生产厂商的两性电解液重复度性较差，其避光4℃保存。Bio-lyte两性电解质使用期限为一年。