单抗制备流程2.doc

单克隆抗体制备标准化操作方案 第一章 小鼠免疫 小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。 常用的免疫方案：（一） 可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫? ???第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价 （用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。（二） 颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。为挑选免疫反应较好的动物进行融合，第二次免疫后10天左右应从尾部取血，检查抗体滴度。另外，还有脾内注射法和体外培养法。第二章 饲养细胞的制备体外培养细胞时，一般单个或极少数分散状态细胞是不能存活的（或生长不良）必需加入一定量的其他细胞达一定的密度才能生长得好，加入的细胞称为饲养细胞。用细胞融合术建立杂交瘤细胞时，饲养细胞的加入是不可缺少的，常用的有正常小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞，也有人用经过照射或丝裂霉素处理的纤维母细胞，如3T3或Putler等。一、 实验材料1.1 RPMI-1640完全培养液：具体配法见实验方法—细胞融合2.3。1.2 HAT培养液或HT培养液：具体配法见实验方法—细胞融合2.4和2.5。1.3 实验动物： Balb/c或昆明种健康小鼠（雌雄均可）1只，6～10周龄，体重18～ 22克，本院动物中心繁殖和饲养。每只小鼠可取得3～5×106 的滋养细胞，可供铺6块板用，应在融合或克隆前1～2天制备。1.4 离心机一台，血细胞计数板，无菌塑料离心管，96孔细胞培养板。小鼠解剖台板或平皿；无菌眼科剪刀、镊子各数把；大镊子一个；止血钳两个。一次性5ml注射器2套。二、实验方法2.1 将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精5分钟，随即放入超净工作台内，腹部朝上放于平皿内或固定于解剖板上。 2.2??用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜， 以免腹腔液外流。然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。2.3??用注射器吸取5ml RPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，晃动小鼠或反复抽吸几次。用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。如此反复操作3～4次。2.4??1000rpm离心10min，弃上清。2.5??用20～50ml完全培养液重悬细胞，100μl/孔滴加到培养板，置培养箱备用。2.6 观察饲养细胞的生长状态，一般生长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强。 第三章 细胞融合 细胞融合是人工定向制造新细胞品系的重要手段，也是制造单克隆细胞系的关键技术。在保证有良好的亲本细胞、稳定和良好的培养体系的条件下，细胞融合的成败和融合率则取决于融合剂和操作技巧。细胞融合的助融剂和助融手段主要有三种；生物学方法：用仙台病毒或鸡新城疫病毒作助融剂。物理学方法：用电融合仪发出的脉冲电流使相邻的两细胞穿孔而融合。化学方法：用聚乙二醇或血卵磷脂作助融剂。PEG作助融剂是比较方便简单的操作方法，具体方法如下：一、实验材料1.1 眼科镊子、剪刀数把、固定板。1.2 37℃温水。1.3 酒精灯、离心管架、离心管、离心机、5-10ml吸管、1ml吸管、滴管、计数池、平皿数个。二、实验试剂2.1 融合剂：50